脂类细胞化学--苏丹Ⅲ染色法实验重点解读.doc

【实验题目】 脂类细胞化学--苏丹III染色法 【实验目的】 ?了解脂肪染色的原理、掌握脂类标本制片；? ?学习用苏丹III染色法进行脂肪细胞的染色技术；? 3.?学会用断头法处理小白鼠以及小白鼠的解剖方法。 【实验材料与用品】 1.?试剂：苏丹Ⅲ染液、70%乙醇溶液、甲醛钙? 2.?器具：显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，镊子，剪刀，解剖盘? 3.?材料：小白鼠 【实验原理】 脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等。脂肪依其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂以及其他类脂质。脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。 脂肪与类脂类和蛋白质结合时，往往不易显出，但用重铬酸钾、升汞、硝酸钴或硝酸铀氧化组织块或切片，可以显现出脂肪和类脂类。 脂类不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此脂类标本的制作，需用不含酒精或不能溶脂的液体固定，一般常用甲醛类固定剂。? 脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV、苏丹黑或者苏丹红等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。?苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。?苏丹染料也是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。? 脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。? 用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：?冰冻切片、明胶包埋冰冻切片、铺片法。 【实验步骤】 大体流程 具体操作 ?断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜， 并在其下部置一载玻片，用剪刀将肠系膜连同小肠一同剪下。? ?滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。 ?吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。 ?用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。? ?用苏丹Ⅲ染色30分钟。? 6、吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，用显微镜观察。 【实验结果与分析】 I. 单个脂肪细胞是圆球形，内充满桔红（黄）色脂类物质。 图1: 10×10 II. 观察到的细胞染色较浅，可能是滴加染液时进入到盖玻片以下的苏丹III染液的量偏少，或者是用蒸馏水冲洗后没有用酒精冲洗干净，不利于染色。此外，观察到的细胞有些不是一层，而是多层细胞重叠在一起，可能是取肠系膜时，没有将肠系膜展平，导致肠系膜聚集在一起。 图2: 10×40 III. 细胞核呈指环状偏靠细胞膜边缘，细胞外也有散在的脂肪滴。但大部分细胞内的脂肪滴已完全充满整个细胞，可能是观察的时间拖得过长。单个细胞的染色效果不明显，可能是染色时间不足。 图3： 10×40 【注意事项】 小鼠肠系膜很脆弱，易破损，因此找肠系膜时应尽量小心，以免将肠系膜扯破； 要找有血管的肠系膜，因为血管周围一般有脂肪组织保护； 制作装片时尽量用盖玻片撑开肠系膜，可以将小肠连同肠系膜一起剪下来； 不要用力按压盖玻片，以免压破脂肪细胞，影响观察； 5.染色时间要足够长，否则会染色不彻底，橘红色不明显； 6.在染色过程中，要防止装片干燥，随时添加苏丹III染液，防止影响实验结果； 7.在进行观察之前，应当用吸水纸尽可能地吸取染液后再进行观察，这样只有脂肪细胞呈橘 红色，对比较明显。 ? 附： 课外拓展知识 石蜡切片制备 石蜡切片的制作过程主要包括：取材 固定 脱水 透明 透蜡 , 封藏 透明 染色 贴片 切片