转基因小鼠和显微注射以及验证_new重点解读.doc

转基因小鼠制备实验方法1、 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 ? (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。) Southern Blot原理及实验方法DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。? 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,?如是否有点突变、扩增重排等。 一、试剂 变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。 中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。 20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。 2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。 6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。 22cm×15cm瓷盘 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。 2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。 3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。 4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。 5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。 6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。 7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。 8. 把一叠吸水纸（或卫生纸，约有5—8cm高，略小于滤纸），放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。 9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝