组织培养实验一1_new重点解读.doc

实验一 植物组织培养实验的准备 （一）、实验室的设计与布局 1、目的要求 通过认知实习，了解植物组织培养实验室的布局，掌握植物组织培养的程序，同时熟悉组织培养中涉及的各种仪器设备和器皿用具。 2、仪器与用具 超净工作台、蒸馏水发生器或纯水发生器、高压灭菌器、普通冰箱、微波炉、煤气灶或电炉、显微镜、万分之一（或千分之一）电子天平、恒温箱、烘箱、各种培养器皿、分注器、各种实验器皿和各种器械用具。 3、方法步骤 1．结合所学理论知识，学习组织培养实验室守则及有关注意事项。 2．了解植物组织培养的具体流程。 3．了解组培实验室的构建情况，包括准备室、缓冲室、无菌操作室（又称接种室）和培养室的设计要求。 4．了解仪器设备的名称、用途及使用方法。 5．了解实验室中培养材料的一些常用参数，如培养间的温度、光照时数、光照度等。 4、作业 1．植物组织培养实验室一般由几部分构成？各个部分的功能主要有哪些？植物组织培养常用的设备有哪些？ 2．每人设计一个植物组织培养实验室的组建方案。 （二）、培养器皿的洗涤 1、目的要求 了解各种洗涤液的特性，掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器皿的洗涤技术。 2、基本原理 由于组织培养过程中器皿的重复利用，特别是培养基中有机物质及培养组织分泌物的附着，影响再次培养，导致实验结果发生误差，甚至使培养组织受到毒害。同时，一些新制玻璃器皿，都部分的存在碱性游离物，也影响到实验结果的准确性。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，使其达到不留任何残留物的要求。因不同培养器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗的方法也不同。 3、试剂与主要用品 （1）．仪器用具 毛刷、塑料盆、天平、量筒、烧杯、洗耳球、洗刷装置（全自动洗涤机）、高压灭菌器、耐酸手套、玻棒、需洗涤器皿等。 （2）．试剂 肥皂粉、洗衣粉、去污粉、洗洁精、重铬酸钾、浓硫酸、蒸馏水、纯乙醇或95%的乙醇等。 4、操作步骤 （1）玻璃器皿的洗涤（酸洗） 玻璃器皿的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。 ①．浸泡 新的或用过的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，以软化和溶解附着物。新购置的玻璃器皿含有游离碱，应先用自来水简单冲洗，再用1%～5%的HCl浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附着有大量有机物质及培养组织的分泌物，干涸后不易涮洗掉，故用后应立即浸入清水中以备刷洗；被杂菌污染的培养瓶或培养皿等玻璃器皿，应先高压灭菌20min，倒掉污染的培养基后，再浸入清水中浸泡以备刷洗。 ②．刷洗 将浸泡后的玻璃器皿放入肥皂液或洗衣粉液中，用毛刷反复刷洗，刷洗中要不留死角，并防止破坏玻璃表面的光洁度。将刷洗过的玻璃器皿冲洗干净、晾干，准备浸酸。 ③．浸酸 将上述玻璃器皿浸泡到重铬酸钾洗涤液（又称酸液）中，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面残留的物质。根据洗涤液中含硫酸的比例，将洗涤液分为强酸，次强酸和弱酸三种（表2-1）。根据需要配制洗涤液，洗涤液对玻璃无腐蚀作用，去污效果好，用其洗是保证器皿洁净的关键一环。 配制洗涤液时，操作者必须小心认真，戴耐酸手套和防护眼镜，并严格按下列方法进行。 表1 重铬酸钾洗涤液的配方 成 分 强 液 中 液 弱 液 重铬酸钾（g） H2SO4 (ml) 蒸馏水(ml) 63 1000 200 120 200 200 100 100 1000 （1）按配方称量好重铬酸钾和蒸馏水，然后将重铬酸钾完全溶于蒸馏水中（可加热）。 （2）按配方把工业用浓硫酸缓慢（以产热很少为宜）加入冷却的（1）中，边加边搅拌。 （3）自然冷却、备用。洗涤液为强氧化剂，去污力强，可以洗去玻璃器皿或瓷质器皿上的有机物，切不可洗涤金属器皿。配制、盛装洗涤液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。洗涤液在使用过程中和使用后都应保持密闭，防止氧化变质。新配制的洗涤液呈棕红色，当使用时间过久，洗涤液的颜色变暗、发绿或浑浊时，应弃去（深埋地下），重新配制新的洗涤液。 一般来说，新的和用过的玻璃器皿都应浸酸，那些无法用毛刷刷洗的用品（如吸管、滴管等）更要靠浸酸去除污物。浸酸时，器皿应完全被洗涤液充满和覆盖。浸酸时间不少于6h，一般要过夜或更长时间。将器皿放入洗涤液时，应小心操作，防止伤及皮肤、眼睛或衣服。从洗涤液中取出器皿时，应沥干洗涤液，并将浸酸的器皿放入合适的容器，如塑料盆中运输。 ④．冲洗 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到组织培养的成败。冲洗可用洗涤装置，也可手工操作。手工洗涤浸酸后的器皿时，每件器皿都至少要重复“注满水——倒空”15次以上，最后用蒸馏水浸洗2～3次，晾干或烘干后包装备用。 载玻片与盖玻片的洗涤：先用流水冲洗，再将其浸入含有1%～2%盐酸的95%乙醇液中浸泡6～12h，流水冲洗后再浸入