外排泵抑制剂对铜绿假单胞菌耐药性的影响--田菁菁教案.ppt

前 言 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)为临床上最常见的引起严重医院感染的条件致病菌，主要感染医院内免疫力低下患者，其高度耐药和多重耐药性使得治疗成为一大难题。随着碳青霉烯类、氟喹诺酮类抗菌药物临床应用的日益广泛，铜绿假单胞菌对这两类抗菌药物的耐药率也逐渐上升，目前国内外大量研究发现，其耐药与主动外排泵的过度表达有关。 细菌的耐药机制 1、产生灭活酶,使抗菌药物失活或结构改变。 2、改变细菌细胞壁的通透性,使抗菌药物不能进入菌体内。 3、细菌体内抗菌药物作用的靶位结构改变,使之不能与抗菌药物合。 4、形成代谢拮抗剂与药物争夺靶酶。 5、通过主动外排作用,将药物排出菌体外。 6、细菌分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包绕形成细菌生物被膜。 外排泵抑制剂（EPIs) 外排泵抑制剂(EPIs)不仅可以抑制耐药细菌对药物的外排,恢复其对药物的敏感性,提高耐药细菌的临床治疗效果,而且在改善某些药物的药动学特性(如提高口服药物的吸收,降低肝、肾清除率)方面也有广泛的用途。 外排泵抑制剂（EPIs)的作用机制分为: (1)干扰外排泵组装; (2)阻断外排泵能量来源; (3)阻碍底物通过外排通道; (4)机制未知。 菌 株 30株铜绿假单胞菌来源于某医院临床标本，剔除重复菌株。经梅里埃Vitek-32型细菌鉴定系统鉴定。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。 药品和试剂 亚胺培南(IMP)、美罗培南(MEP)，购于沈阳制药有限公司； 环丙沙星(CPLX)及左氧氟沙星(LVLX)，购于深圳生物制品检定所； PAβN、奥美拉唑、MH琼脂培养基，购于美国Sigma公司。 琼脂对倍稀释法 培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2-7.4。 含药琼脂平板制备：根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45-50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3-4mm。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2-8℃冰箱可贮存5天。 接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1-2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5-8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16-20h，观察结果。 试验分组 生长对照组： 制备仅含外排泵抑制剂(EPIs) PAβN和奥美拉唑的培养基。 实验组： PAβN与亚胺培南(IMP)、美罗培南(MEP)联合时为40μg/mL，与环丙沙星(CPLX)及左氧氟沙星(LVLX)时为20μg/mL； 奥美拉唑与亚胺培南(IMP)、美罗培南(MEP)、环丙沙星(CPLX)及左氧氟沙星(LVLX)联合时均为20μg/mL。 结果判断方法 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，按照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐方法测定并读取结果。以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。比较应用EPI前后菌株对4种抗菌药物MIC值的变化，MIC降低为原值的1/4或更低则判断为外排泵阳性株。 预测结果 1. PAβN对碳青霉烯类、氟喹诺酮类抗菌药物抗菌活性的影响 PAβN浓度为40μg/mL时，能明显增强碳青霉烯类对铜绿假单胞菌的抗菌活性，PAβN浓度为20μg/mL时，即能明显增强氟喹诺酮类对铜绿假单胞菌的抗菌活性。 2.奥美拉唑对碳青霉烯类、氟喹诺酮类抗菌药物抗菌活性的影响 奥美拉唑20μg/mL时，对碳青霉烯类、氟喹诺酮类的抗菌活性影响均较小 讨论分析 PAβN即MC-207110是通过结合外排泵相应位点以阻止其他底物与该位点的结合，减少药物的外排。PAβN除了能抑制铜绿假单胞菌RND型外排泵，还可抑制其他一些革兰阴性菌的RND型外排泵，如沙门菌属、大肠埃希菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。 奥美拉唑为H+-K+-ATP酶(又称质子泵)抑制剂，通过破坏跨膜电化学梯度，从而阻断外排泵能量来源，影响药物的外排。AeschKmann等已证明它可以抑制金葡菌NorA外排泵，可使NorA高表达株的诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星MIC降低至原值的1/4-1/8。 前 景 适当浓度的外排泵抑制剂对增强碳青霉烯类、氟喹诺酮类的抗菌活性具有增效作用。外排泵抑制剂(EPIs)不仅可以抑制耐药细菌对药物的外排,恢复其对药物的敏感性,提高耐药细菌的临床治