代谢工程与调控 第五章.ppt

法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干扰。 实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。 √1995年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯(Kenneth　Kemphues)指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基因的表达。 √1998年，卡耐基研究院 Andrew Fire的研究证明， 在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是微量双链RNA（污染）。是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对 基因表达的阻断作用被称为RNA干扰。（RNAinterference,RNAi）。 可惜的是，郭苏和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNA干扰。　 郭苏后来到加州大学旧金山分校（UCSF）任职。她说：“他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃……我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁·法尔和克雷格理应获奖。” 启示：在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证明，不要被误导。 RNAi现象的普遍性 RNAi现象广泛存在于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。 RNA干扰的机理 参与RNAi反应的酶 Dicer酶：是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。RNA酶Ⅲ是一 种能切割双链RNA的酶。Dice r酶参与RNAi反应，广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物。 结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，称为siRNA（short interference RNA），它启动了细胞 内的RNAi反应。 RdRP：细胞内存 在RNAi效应的扩增 系统。能以RNA为模 板指导RNA合成的聚 合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。 在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的 反应过程，呈指数级的数量扩增 Dicer RNA诱导的沉默复合体(RISC) 在RNA干扰机制中，双链RNA诱导同源RNA降解的过程依赖 于RNA诱导的沉默复合体的活性。RISC由Dicer酶， Argonaute蛋白，siRNA等多种生物大分子装配而成。 RISC中的Dicer具有RNAase ш 结构域，在RNAi的起始阶段负责催化 siRNA的产生，在RISC装配过程中起稳定RISC中间体结构和功能的 作用；Argonaute蛋白是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI两个主要的 结构域，前者为siRNA的传递提供结合位点，后者是RISC中的酶切割 活性中心；siRNA是RISC完成特异性切割作用的向导，在成熟的RISC 中虽然只包含siRNA一条链，但siRNA在RISC形成过程中的双链结构 是保证RNAi效应的决定因素。 RNAi的反应过程 1.双链RNA进入细胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA； 2.在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA； 3.SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物， 同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶降解， 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。 4.结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被 裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作 用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加， 显著增加了对基因表达的抑制。 RNAi的应用 RNA干扰作为一种简单快速、特异、高效、经济、效果可预测的技术， 具有明显的优势，它比反义核酸优越，比基因敲除简单，具有很好的应用前景，具体可用于以下几个方面： 1.基因功能分析 2.研究信号传导通路的新途径 3.新药物的研究与开发 4.基因治疗 5.其他应用 RNA干扰技术自被发现以来在不断地发展中，由繁变简，近年来一些RNA干扰技术被应用于代谢工程中，并取得了一定的成果…… 1 真核体系中 的RNA干扰 2 3 最先发现的RNA干扰机制，但因其机制较为复杂，过程中涉及到酶及复合体等，设计实验运用到实际中较为繁琐，有一定的操作困难 需要蛋白辅助的RNA干扰 不需蛋白辅助的RNA干扰 sRNA需要在