实习二红细胞网织红细胞检测教案.ppt

实验诊断实习二红细胞、网织红细胞检测 目的和要求 熟悉正常红细胞和网织红细胞的形态学特点 掌握血红蛋白测定方法、参考值和临床意义 掌握血细胞多参数报告单的正常值及其增减的临床意义 红细胞计数(red blood cell count) 红细胞计数是取一定微量血液，经稀释后计算出血液内所含红细胞数目 原理：用等渗稀释液将全血稀释至一定倍数，充入血细胞计数池，在光学显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求出每升血液中的红细胞数量 方法：显微镜计数法 器材及试剂：  取血吸管，一次性定量采血管 (20ul) 计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为 9 个大方格面积为 Imm 2 。中央大方格用于红细胞计数，被双线等分成 25 个中方格，每个中方格又划分为 16 个小方格 。计数板与盖玻片组成计数池，计数池深度为 0.1mm 显微镜 、盖玻片、刺血针、棉花等 小试管、刻度吸管 、红细胞稀释液。 其它 : 75% 酒精棉球及干棉球 操作 : 取血： 选择耳垂边缘或指端，先用75%酒精棉球消毒局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约 2 毫米。待血液从针孔流出，用于棉花擦去第一滴血 轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。操作者用右手平拿取血吸管尖端浸入血滴中，缓缓吸血恰至“ 10 ”刻度处为止。然后用干棉花擦净吸管外沾附的血液 稀释及混匀 先准备一清洁小试管，精确滴入红细胞稀释液 1.99 毫升，备用 将取好的血液立即挤入上述试管中，并来回吸取小量稀释液数次，以便将残余在吸管中的血液全部洗净 摇动试管，充分混匀。此时血液被稀释 200 倍 充池 先将计数板及盖玻片擦干净，并将盖玻片复盖于计数池上面。 用吸管吸取己充分混匀的稀释血液一滴，滴于盖玻片的下方边缘处，稀释血液即充填入计数池中。注意勿发生气泡或使稀释血液流入计数池旁小槽内 静置 2 － 3 分钟，待红细胞完全下沉稳定后进行计数 计数 平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央大方格。观察红细胞是否均匀，并调整至视野中间。 再转换高倍镜计数。镜下红细胞为圆形或盘形、略带黄色的细胞。如将上侧线和左侧线上的红细胞都计数在内，则不要再将下侧和右侧线上的细胞计入 。计数时必须按一定方向和顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。 计数 5 个中方格 ( 即四角的及中央的中方格 ) 由红细胞总共的个数，将其结果乘以 10 。即得每立方毫米血液中所含红细胞数目，再乘以 10 。即得每升血液中所含红细胞数目。 每升血液中红细胞数目 = 五个中方格内红细胞个数× 5( 变为 0.1u1) × 10 ( 变为 1 u1) × 10 6 ( 变为 1L) × 200( 稀释倍数 )= 五个中方格内红细胞个数× 10 10 清洁仪器： 计数后，将盖玻片及计数板用水冲洗干净，再用绸或细布擦干 吸管先用蒸馏水，继用 95% 酒精，后用乙醚洗涤干净，保存备用 注意事项 不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血 所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水 操作迅速，充池一次完成，不能有气泡 红细胞分布不均，每个中方格之间相差大于 20 个时要重新充池计数 血红蛋白测定 方法：氰化高铁血红蛋白测定法 原理： 血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白（HiCN） HiCN在540nm有一吸收峰 测定其光密度而得血红蛋白浓度 [试剂与器材] 器材： 分光光度计 试管，试管架 取血吸管:一次性定量采血管 (20ul) 刺血针 蒸馏水 75%酒精及干棉球 试剂： 氰化高铁血红蛋白稀释剂 高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]200mg 氰化钾（KCN）　　　　50mg 无水磷酸二氢钾140mg Triton X-100 　　　　1.0ml 用蒸馏水溶解并稀释　 至1L 该试剂应呈透明、淡黄色，pH在7.0～7.4之间，以蒸馏水作空白，在540nm比色，读数是0 溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至少可稳定数月 如发现试剂变绿、浑浊则不能使用 其中非离子表面活性剂可加速溶血，缩短转化时间，防止血浆蛋白改变引起的浑浊 [实验步骤] 在试管中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml，作为测定管 用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1，擦去管端血迹，置于试剂中，冲洗3次，混匀 将混合液放置3分钟以后，倒入光径1cm比色皿，用分光光度计在540nm进行比色 以蒸馏水或HiCN稀释试剂作空白管，校正光密度到0点，读取测定管光密度读数 计算： ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 血红蛋白（g/L）= 测定管光密度×（64458/44000）×251 ? ? ? ?