实验八亲和层析分离纯化蛋白质教案.ppt

样品制备 待纯化蛋白：GST标记的纤维素酶 来源：重组大肠杆菌 提取方法：超声波破细胞释放GST-纤维素酶 条件：超声处理3秒，间歇5秒，共15分钟。 4000rpm离心5分钟，取上清（混合蛋白质溶液）上柱。 亲和层析分离纯化目标蛋白 实验目的 掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法（第一部分） 掌握SDS检测目标蛋白原理和方法（第二部分） 第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白 亲和层析原理 生物大分子与配体特异非共价可逆结合 酶-底物 酶-底物类似物（酶的竞争性抑制剂） 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT） 亲和层析原理 GST亲合层析 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱甘肽GSH特异结合） GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上，（Sepharose 4B） GST融合目标蛋白 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白 GSH- Sepharose 4B GSH- Sepharose 4B GSH- Sepharose 4B 实验步骤 一、装GST柱 1、清洗和装好层析柱，封闭出口。 2、加入2 mL PBS。 3、取1 ml GSH- Sepharose 4B填料，加入柱子中。 4、打开柱子出口，使PBS缓慢流出。 注意：始终保持柱内的液面高于填料 二、纯化目的蛋白 1、用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2、将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3、用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4、加入1ml 洗脱液。 5、用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml（约4滴）。 6、PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7、将第2管和第3管用于目的蛋白的检测。 SDS样品制备 1号样： 过柱前的蛋白溶液25uL，加5uL 5X上 样缓冲液。 2号样： 洗脱的蛋白溶液（2号管）25uL，加5uL 5X上样缓冲液。 3号样： 洗脱的蛋白溶液（3号管）25uL， 加5uL 5X上样缓冲液。 点样前沸水中加热3-5min。 第二部分SDS检测目标蛋白 实验目的 掌握SDS检测蛋白分子量原理和方法 掌握垂直板电泳的操作方法 蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系： logMW=K-bm 实验原理 不连续系统: 缓冲液离子成分、pH、 凝胶浓度及电位梯度的不连续性。 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。 电荷、分子筛效应。 （三个不连续性） 1、凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶） 2、缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。 3、电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。 浓缩效应 实验步骤 1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。 3、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间。 4、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约15min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。 5、倒出水并用滤纸吸干，配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约20分钟。 ※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。 12%分离胶 试剂名称 12%分离胶 ddH2O 2.5 mL 30% Acr-Bis (29:1) 3.0 mL 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2.0 mL 10% SDS 75 uL TEMED（加速剂） 10 uL 10% APS（催化剂，最后加） 75 uL 总体积 7.5 mL 试剂名称 5% ddH2O 1.7 mL 30% Acr-Bis （29:1） 0.43 mL 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.31 mL 10%SDS 25 uL TEMED 10 uL 10%AP（最后加） 25 uL 总体积 2.5 mL 5%浓缩胶 6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-G