实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌教案.ppt

实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌 实 验 目 的 学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 为下一步重组体筛选做准备 实 验 原 理 遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过程就是转化。 将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、 CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Competent cells)。 转化(Transformation) 是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击（如42 ℃ ）下，细胞可吸收外源DNA。 为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。 Ampr：氨苄西林抗性基因 – β内酰胺酶 多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点 Amps菌株 Ampr 涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落-- 转化子。 培养基上含有X-Gal和IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。 pET32a pET32a 结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 复制起始位点 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等 pET-32a Vector The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli. pET-32 cloning/expression region Vector (pET-32a) Gene fragment (SmPR10) pET32a-SmPR10 材料、设备及试剂 材料 E. coli DH5α菌株: R-、M-、Amp- (转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。） pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2 ng/μl): 实验室自制 设备 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。 试剂 1、LB固体和液体培养基 LB培养基配方：（单位g/L） 胰蛋白胨 10 酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂粉（1.5%） 15g （注：LB液体培养基不加琼脂粉） 按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。 2、Amp母液： 称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱. 3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于4℃冰箱储存 . 4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制 操 作 步 骤 （一） 受体菌的培养 1、取-70℃或-20℃贮存的大肠杆菌DH5α菌种，