PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制.docVIP

PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制 余波 谭诗文(1 冉懋韬1 杨丽娟1徐景峨1 史开志1 （贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳550005） 摘要：根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、猪圆环病毒2型(PCV-2) ORF2、猪细小病毒(PPV) VP2基因序列，设计了3对引物，研制了检测PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带分别为bp、bp、bp。敏感性、特异性结果显示，该试剂盒对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 4.2pg/L、PCV-2 3.7pg/L、PPV 0.ng/L，而猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）、大肠杆菌、猪支原体的扩增结果均为阴性。对125份自然感染病猪样品的检测结果表明，该试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该多重PCR试剂盒具有很好的特异性和敏感性，可用于临床PRV、PCV-2和PPV的检测。 PRV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）造成的猪繁殖障碍性疫病越发严重，常常出现混合感染，给养猪场造成了巨大的经济损失[1-3]。目前，主要的检测方法有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA、PCR方法。然而常规的诊断方法很难将此症状相似的疾病同时加以区别，而且常规的病原学和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）诊断方法可一份样品中同时检测出多种病原体，且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低，适合大量临床样品（特别是混合感染样品）中病原体的快速诊断。本研究根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、猪圆环病毒2型(PCV-2) ORF2、猪细小病毒(PPV) VP2基因序列，设计了3对引物，研制了检测猪PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒RV、PCV-2和PPVPRV、PCV-2、CFSV石门系株、PRRSV美洲株株、大肠杆菌、支原体为本研究室保存。 1.2 主要试剂 Goldview、Tris、EDTA、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10Taq Buffer、dNTP等购自；GenBank中登录的(PRV) gE、PCV-2 ORF2和PPV VP2基因组序列，应用DNAStar软件，设计了3对引物，用于扩增PRV、PCV-2、PPV目的基因片段，引物的序列。PRV上游引物：5’ –CCCACGCACGAGGACTAC–3’，PRV下游引物：5’ –GGGCGGGACATCAACAGG–3’ ，目的片段大小300bp。PCV-2上游引物：5’–GGATTGTATGGCGGGAGG–3’PCV-2下游引物：5’ –AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’，目的片段大小420bp，PPV上游引物： 5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’，PPV下游引物：5’ –TTGTTTGCCA TGAGTGAGTT–3’， 目的片段大小680bp。 1.4 病毒核酸的抽提 取待检样品肝、脾、肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约0.2 g，加入500μL PBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于－70℃保存。支原体、大肠杆菌DNA用煮沸法提取DNA。 1.5 单一病毒PCR扩增 单一病毒的PCR反应在25 μL体系中进行，Primer1/2各μL、10×Taq Buffer 5μL、dNTP mixture μL、Taq DNA polymeraseμL、ddH2O 加至 μL，94℃ 5 min；94℃ 30s，55℃1 min，72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。取5μLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 1.6 多重PCR反应条件的优化 对多重PCR反应条件，包括退火温度（54～60℃），引物浓度（5～20 μmol/L），Taq DNA polymerase浓度（0.5～3.5 U）进行优化，以确定最佳反应条件，同时以双蒸水作为空白对照。多重PCR反应在50μL反应体系中进行，10×Taq Buffer 10μL，dNTP mixture 8μL；Taq DNA polymerase 1μL，用双蒸水补足至50μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，54～60℃ 1 min，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min。取5μL PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 1.7 敏感性试验 将提取的