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PCR发展历程 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR应用 MIQE 微滴式数字PCR原理 (To be or Not to be) BIO-RAD定量产品线 MiniOpticon CFX Connect CFX96 Touch CFX384 Touch CFX系列定量PCR仪发表的文献 CFX系列定量PCR仪发表的文献 CFX系列定量PCR仪发表的文献 Bio-Rad CFX96 Touch 仪器组成 该款仪器由 先进的光学系统 卓越的热循环系统 功能齐全、操作便捷的软件构成。 8.5寸彩色触摸显示屏，使控制，程序的编辑、保存、浏览、运行更加简便、快捷。 在屏幕上可以实时查看指定孔的扩增曲线，是第一台真正可以摆脱电脑独立运行的定量PCR仪。 全自动热盖 仪器本身可存储100个原始结果 可通过USB接口无线扩展内存 一机两用(既可以当做定量PCR又可以当做定性PCR使用) 利用样品孔选择器可以方便地指定需要显示扩增曲线的孔或者区域 可以在触摸屏上实时查看指定孔的扩增曲线 新特点——可独立运行，实时查看指定孔的扩增曲线 光源： 6个LED+6个特异激发波长滤光片 检测器：6个PDT+6个特异检测波长滤光片 LED光源： 特异性最好 寿命最长 稳定性最好的冷光源 无光程差，无需校正 PDT检测器： 直接将光信号转换为电信号 光学系统 热循环系统 专利的“蜂巢式”加热模块 升温速度：5℃/s 降温速度：5℃/s 热循环系统 dynamic thermal gradient 10oC Above 6oC Below 利用温度梯度优化体系 软件 一、CFX Manager 软件 ----------可同时控制4台定量PCR仪器 ----------功能强大，提供所有的定量数据分析方法 如-△Ct，2 - △ △ Ct 多参照基因分析和扩增曲线计算，多个数据文件的基因表达分析（1次最多可分析5000个孔的数据），等位基因分析，终点分析等，所有数据结果可以Excel,Word,Powerpoint或PDF格式保存。软件除了无限制随意安装外，还有中英文版本。 二、精确熔点分析软件 ----------应用的拓展，可以使用HRM软件进行SNP（单核苷酸多肽性），甲基化等方面的研究。 实验向导 软件 CFX Manager 软件 2012 Life Science Research 2012 Life Science Research 2012 Life Science Research 2012 Life Science Research * SYBR Green I dye has an increased fluorescent intensity when bound to double stranded DNA. * When sample is denatured, signal drops. When more double stranded DNA is generated, the signal increases proportionally with the amount of dsDNA present. * The software plots the first derivative which simplifies the analysis. * TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 TAQMAN ? probes consist of an additional oligo (internal to the primers) that is label at the 3’end with a fluorophore and quencher at the 5’end. With this combination the fluor signal is “hidden” as the quencher ab