冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞).docVIP

冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞） Yixing Naoyan Miehuoyimiao (Vero Xibao) Japanese Encephalitis Vaccine（Vero Cell），Inactivated 本品系用乙型脑炎(以下简称乙脑)病毒接种于Vero细胞, 经培养、收获病毒液、灭活病毒、浓缩、纯化后，加入稳定剂冻干制成，用于预防乙脑。 1. 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合 “凡例”有关要求。 2. 制造 2.1 生产用细胞 生产用细胞为Vero细胞。 2.1.1 细胞库的管理及检定 应符合 “生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 各种子批代次应不超过批准的限定代次，取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏、扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。 2.1.2 细胞制备 取工作细胞库中的1支或多支细胞管，细胞复苏、 扩增至接种病毒的细胞为1批。将复苏后的单层细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化， 分散成均匀的细胞， 加入适宜的培养液混合均匀，置35℃~37℃培养形成致密单层细胞。 2.2 毒种 2.2.1名称及来源 生产用毒种为乙脑病毒P3株。 2.2.2种子批的建立 应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。 乙脑P3株原始种子应不超过第53代， 主种子批和工作种子批的代次应不超过批准的限定代次。 2.2.3种子批毒种的检定 主种子批应进行如下全面检定，工作种子批至少应进行2.2.3.1-2.2.3.5项检定。 2.2.3.1鉴别试验 将毒种10倍系列稀释，取10-1～10-5稀释度的病毒液与乙脑特异性血清等量混合，取10-4～10-8稀释度的病毒液与乙型脑炎非特异性血清等量混合作为对照组，于37℃水浴中和90分钟，试验组和对照组体重为7-9g 昆明鼠或其他品系小鼠20只，每只脑内注射0.03ml，逐日观察，3日内死亡不计，观察14天，计算中和指数应不低于500。 2.2.3.2无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 2.2.3.3支原体检查 依法检查（附录XII B），应符合规定。 2.2.3.4 病毒滴定 将毒种10倍系列稀释，取10-6~10-9稀释度病毒液脑内接种体重为7～9g 昆明鼠或其他品系小鼠，每稀释度注射小鼠4只，每只0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，病毒滴度应不低于8.0 Lg LD50/ml。 2.2.3.5 病毒外源因子检查 依法检查（附录XII C），应符合规定。 2.2.3.6免疫原性检查 用主种子批毒种制备原疫苗，腹腔免疫体重为12～14g NIH小鼠10只，每只0.3ml，免疫2次，间隔7天，初免后第14天， 对免疫组和未经免疫的对照组小鼠用不低于10 000 LD50病毒量的非生产用乙脑病毒P3株进行腹腔攻击，同时各组小鼠每只脑腔注射0.03ml稀释液。21天后免疫组应100%保护，对照组死亡率应不低于80%。 2.2.4 毒种保存 冻干毒种保存于-20℃以下，液体毒种保存于- 60℃以下。 2.3 原液 2.3.1 细胞制备 按2.1.2项进行。 2.3.2 培养液 培养液为含有适宜浓度灭能新生牛血清的199或其他适宜培养液。新生牛血清的质量应符合要求（附录XIII D），且乙脑抗体应为阴性。 2.3.3 对照细胞病毒外源因子检查 依法检查（附录XII C），应符合规定。 2.3.4 病毒接种和培养 细胞生长成致密单层时，弃去细胞培养液，用Earle’s液充分冲洗细胞,除去牛血清后,加入MEM维持液。工作种子批毒种按0.05(0.3MOI接种（同一批工作种子批应按同一MOI接种）。 置适宜温度下培养。 2.3.5 病毒收获 经培养60-84小时，澄清过滤后收获病毒液。根据细胞生长情况，可加入新鲜维持液继续培养， 进行多次病毒收获。同一细胞批的病毒收获液检定合格后可合并为单次病毒收获液。 2.3. 单次病毒收获液检定 按3.1项进行。 2.3. 病毒灭活 应在定的蛋白质含量范围内进行病毒灭活。单次病毒收获液中加入终浓度为200ug/ml甲醛，置适宜温度灭活一定时间。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样， 分别进行病毒灭活验证试验。 2.3.超滤浓缩 病毒灭活适宜倍数的超滤浓缩。 2.3.纯化 浓缩后的病毒液采用蔗糖密度梯度区带离心法或其他适宜的方法进行纯化。 2.3.1脱糖 将收集液以截留分子量100kD的膜进行超滤脱糖后，可加入适宜浓度的稳定剂，即为原液。 2.