实验九、诱变物质的微核试验.docVIP

本科学生综合性 实验报告 学号 姓名 杨万坤 学院 生命科学学院 专业、班级 11应A 实验课程名称 遗传学 指导教师及职称 ＿＿＿＿＿ 开课时间 2012 至2013 学年 下 学期 填报时间 2013 年 5 月 22 日 云南师范大学教务处编印 实验名称：实验九、诱变物质的微核试验 实验时间：2012/5/20 实验地：睿智楼3幢222 (基础生物学实验室4) 一、实验预习 实验目的 1、了解微核发生的机制； 2、掌握微核实验的一般程序和实践意义； 3、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； 4、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。 实验设备及材料 仪器和器械： 生物显微镜、解剖剪、镊子、注射器、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。 试剂及配制： （1）小牛血清（灭活） 将滤菌的小牛血清置于56℃恒温水浴保温30min灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里。 （2） 姬姆萨（Giemsa）染液 成分：Giemsa染料 3.8g、 甲醇 375mL、 甘油 125mL。 配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375mL和甘油，混合均匀，放置37℃恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次，促使染料的充分溶解，取出过滤，两周后用。 （3）0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8） 成分：磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 71.64g/L 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ·2H2PO4） 31.21g/L 分别加蒸馏水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸馏水混匀，即为pH6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液。 （4）Giemsa应用液 取2ml Giemsa染液与40ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。临用现配 实验动物 小鼠是微核试验的常规动物。体重为25g ~35g。也可选用成年大鼠，体重为150g ~200g。 剂量分组 一般取受试物一般至少设3个剂量。每个剂量组5只动物。另外，还应设溶剂对照和阳性物对照组。常用环磷酰胺作为阳性物对照，剂量可为40mg/kg体重。 实验原理及实验流程或装置示意图： 实验原理 微核 （Micronucleus）：染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 实验流程： 购买小白鼠（体重为25g-35g，最好雌雄各半）断颈制取骨髓 离心并涂片固定后保存 Giemsa染色后冲洗封片并观察、计数. 实验方法步骤及注意事项： 染毒途径和方式 染毒途径视实验目的而定，常用腹腔注射，24小时取材。 试验方法 （1）骨髓的制取：①用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出，擦净股骨上的肌肉。去股骨的髋面，将吸有0.85% Nacl生理等渗液小注射器的针头插入，反复几次吹出骨髓细胞。反复吹打使其混合均匀，制成细胞悬液。 ②将细胞悬液在1000转/分离心5分钟，弃除上清液。 （2） 涂片：在离心管中加入少量的小牛血清（约0.3ml)混匀后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm ~3cm (涂片时一次涂成）。在空气中晾干。 （3） 固定：将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。即使当日不染色，也应固定后保存。 （4） 染色：将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色20min ~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗。 （5