第八酶的固定化精要.ppt

不稳定：在高温、高压、强酸、强碱下易失活， 即使在最适条件下反应； 2. 回收困难，不能重复使用：经济上不合算； 3. 反应速度减慢，不容易与毒副分子和产物分离。 游离酶的不足： 什么是固定化酶？ 水溶性酶 水不溶性载体 水不溶性酶（固相酶、固定化酶） 固定化技术 固定化酶：固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 酶的固定化 固定化酶的优点 增加酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效率，降低成本 易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化提纯工艺 酶反应过程可严格控制 较游离酶更适合多酶反应 增加产物收率，提高产物质量 5.1.1 酶的固定化方法 微囊型 固定化方法 吸附法 结合法 交联法 包埋法 网格型 共价键 结合法 离子键结合法 B. 半透膜包埋法(微囊）： 将酶或细胞包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。(适用于产物、底物分子量小的） ① 常用载体———半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 ② 制备方法：将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊之中。 四、交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 交联的形式： （1）酶直接交联法 （2）酶与辅助蛋白交联法 固定化 方法 结合法 包埋法 吸附法 交联法 离子键 共价键 制备难易 易 难 较难 易 较难 结合程度 中等 强 强 弱 强 活力回收 高 低 高 高，酶易流失 中等 再生 可能 不能 不能 可能 不能 固定化成本 低 高 低 低 中等 底物专一性 不变 可变 不变 不变 可变 各种固定化方法的优缺点比较 各种酶固定化方法的比较 方 法 优 点 缺 点 吸附法 制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用 结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小 包埋法 操作简单，固定化酶活力较高，适用性广。 仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题 离子键结合法 条件温和，操作简便，活力损失小，结合量大。 由于离子键结合力弱，酶与载体之间结合不牢固，在pH、离子强度等条件改变时，酶易脱离。 共价结合法 载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强，非常稳定 偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性，制作较繁琐 交联法 可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高，可长期使用 反应条件较激烈，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。 热处理法 制作方便，酶活力高，稳定性高 只适用于热稳定性好的酶 5.1.3 固定化酶的特性 （1）酶的活性 ： 通常低于天然酶（有例外）。 （2）酶的稳定性 酶的热稳定性、储存稳定性、操作稳定性以及对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。 可能的原因： ①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形； ②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 （3）酶的最适温度 最适温度变化不大。 有些酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。 （4）酶的最适pH a.载体性质的影响 b. 产物性质对最适pH值的影响 带负电荷载体 ： 产物为酸性：最适pH值高一些； 最适pH 向碱性偏移。 产物为碱性：最适pH值低一些； 带正电荷载体 ： 产物为中性：最适pH值一般不改。 最适pH 向酸性偏移。 （5）米氏常数 米氏常数Km反映了酶与底物的亲和力。使固定化酶Km变动的原因，主要是由于载体与底物间静电相互作用。 固定化载体与底物电荷相反，固定化酶的表观Km值降低。 固定化载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km值显著增加。 （6）底物特异性 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。 1. 同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次的使用； 2. 易与底物、产物分开有利于控制生产过程；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 3. 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性； 4. 较能适应于多酶反应； 5. 提供了研究酶动力学的良好模型。 固