第蛋白质精要.ppt

三、电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 电泳法分离分析蛋白质： 带电颗粒在电场中向其所带电荷相反方向移动的现象叫电泳。 几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 （1）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物――根据电荷多少，分子大小，形状差异在电场中泳速不同而分离。 凝胶可制成板状或柱状，电泳装置可水平式或垂直式。 连续电泳――凝胶、电泳槽液的PH和离子强度相同 不连续电泳――凝胶的浓度、pH、电压、BS都不相同 （2）、SDS――用来测定蛋白质的分子量 电泳迁移率是根据蛋白质带电荷多少、分子大小及形状决定的。可能出现两个分子量不同的蛋白质，以相同速度移动的现象。 SDS →蛋白质非共价键破坏 →蛋白质变性＋SDS →带大量负电荷复合物 加入SDS后迁移率主要取决于蛋白质的分子量，与所带电荷及形状无关。大多数蛋白质的迁移率与其分子量的对数呈线性关系 用已知分子量的一组蛋白质作图绘制标准曲线，用相同条件检测样品，可推算出未知样品的分子量。 （3）、等电聚焦电泳 用两性电解质（ampholine）在电场中形成pH梯度，使蛋白质样品在它们PI相应的PH区域集中，PI不同的蛋白质泳动后形成不同的区带而得到分离，此法称为等电聚焦电泳。 此法分辨率高，可区分pI只有0.01pH差异的蛋白质。 对稀的样品可起到浓缩作用，故可用于分离分析和纯化蛋白质样品。 （4）、双向电泳 第一向电泳结束后，在其垂直的方向作第二向电泳。 有人用此法从大肠杆菌中分析出近1100种蛋白质（第一向用PAGE等电聚焦，第二向用SDS） 四、层析分离蛋白质 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 五、超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 六、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 七、蛋白质空间结构测定 * 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。 * 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 * 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。 同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高