第二蛋白质精要.ppt

第一节 氨基酸 第二节 肽 第三节 蛋白质的分离与鉴定 第四节 蛋白质的结构 第五节 蛋白质的变性与复性 生老病死，万物轮回(蛋白质层次) 生（诞生、生长）：在蛋白质（酶）控制（催化）下的老细胞计划性凋亡和新细胞的再生（细胞新陈代谢）、活细胞物质的代谢。 老？ 蛋白质功能的普遍衰退(?)。 病——个别蛋白质的功能障碍。 死？ 蛋白质功能的全部停止,分解。 蛋白质——生物功能分子 蛋白质分布广泛、功能多样 1. 催化功能-酶 2. 结构功能-皮、毛、骨、牙、细胞骨架 3. 载运功能-膜蛋白 4. 调控功能-激素 如胰岛素 组蛋白 5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白 6. 防御功能-免疫球蛋白 7. 接受和传递信息 视色素 味觉蛋白 一、氨基酸的种类与结构 （一）氨基酸的结构共性 含有氨基的羧酸 20种“标准氨基酸”， 均为α-氨基酸 R-CH（NH2）-COOH R 代 表 氨 基 酸 之 间 相 异 的 部 分 ， 叫 R 基 (R group)， 又 称 为 侧 链 (sidechain) 。 无色晶体、溶于水 地 球 上 天 然 形 成 的 氨 基 酸 有 300 种 以 上 ， 但 是 构 成 蛋 白 质 的 氨 基 酸 只 有 20 种 , 且都是α-氨基酸（可能还存在更多的）。 提问：什么是α-氨基酸？ 答案： C-C-C-C-COOH γ β α C-C-C-C(NH2)-COOH α-氨基酸 C-C-C (NH2)- C - COOH β-氨基酸 C-C (NH2)- C - C - COOH γ-氨基酸 （二）氨基酸侧链的性质与分类 按侧链(-R)的性质，常见的蛋白质氨基酸被分为三类： 1. 非极性R基氨基酸（共9种）： 甘氨酸(Gly) 丙氨酸(Ala) 缬氨酸(Val) 亮氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 脯氨酸(Pro) 色氨酸(Trp) 甲硫氨酸(Met) 苯丙氨酸(Phe) 3.带电荷的极性R基氨基酸（共5种）： 带正电荷的极性R基氨基酸3种 赖氨酸(Lys), 精氨酸(Arg), 组氨酸(His) 带负电荷的极性R基氨基酸2种 天冬氨酸(Asp) 谷氨酸(Glu) 构型 ：不对称碳原子周围的取代基在空间上的排列。 20种氨基酸除甘氨酸(Gly)外， ?-C都是不对称碳原子，且都为L-构型。 构型的改变需要共价键的的破坏与重新形成，与氢键无关，氨基酸的L- 、D-型都是以甘油醛为标准确定的。 纯晶体状态 加 碱 （二）氨基酸的酸碱滴定曲线 蛋白质的分离步骤 1、材料的选择 2、组织匀浆与破碎细胞获取粗提液 3、蛋白质初步提纯 4、选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白，直到完全纯化 5、目标蛋白的鉴定 一、蛋白质的溶解性质与盐析分离 蛋白质侧链——亲水——水化膜——不易沉淀 影响蛋白质溶解度的因素：盐浓度、溶剂极性、pH、温度 提问：蛋白质胶体溶液的稳定的原因是什么？ 答案： 1.同种蛋白质带有同种电荷，相互排斥； 2.水膜弹性 在蛋白质溶液中加盐：出现盐溶或盐析 盐溶：当盐浓度很稀时，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度升高，这种现象叫做….. 提问：原因？ 蛋白质带电的R基吸附盐，盐增强了与水的结合，使蛋白溶解。 盐析：向蛋白质溶液中加入大量盐后，蛋白质沉淀析出的现象。 提问：原因？ 盐浓度高时，蛋白质水膜被盐抽出，疏水区暴露，相互结合，沉淀。 不同盐浓度下，不同蛋白质沉淀析出,硫酸铵效果最好 盐析后的蛋白需要透析除盐。 利用蛋白质分子较大，不能透过半透膜的性质，用半透膜将蛋白质与无机盐、单糖等小分子物质分开，半透膜一般用玻璃纸或一些合成材料。 二、离子交换柱层析 样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱。 三、凝胶过滤层析 使用有一定大小孔隙的凝胶作层析介质(如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)，利用凝胶颗粒对分子量和形状不同的物质进行分离的层析技术。由于各种分子的大小、形状不同，扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 球状后出来 凝胶法一般只适于球状蛋白分子测量 五、蛋白质电泳 电泳：在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电核符号相反的电极移动，这种现象称为电泳。 垂直电泳 （1） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 用来分离有生物活性的蛋白质，可进行同工酶的检测 【提问】、有一由a、b、c、d、e五种蛋白质组成的混合溶液，其PI分别为3.0、4.0、5.0、6.0、