第二动物组织和细胞的培养精要.ppt

(一)细胞原代培养 1.取材分离 取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水BSS） ，冲洗数次。 2.组织消化： 是用酶法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。 将剪碎的组织块放人三角烧瓶中，加人30～50倍体积的0.25％浓度胰蛋白酶； 消化：37℃水浴内消化30～60分钟。 过滤：如果大部分细胞已经分散，终止消化，以不锈钢筛过滤(100μm）滤除未被消化的组织块。 离心：8000rpm/min离心5分钟，弃上清液,沉淀为细胞。 漂洗；Hanks液漂洗两次，每次2～3分钟，加人营养液 。 3.细胞计数 细胞悬液制成后，需要计数悬液中细胞的浓度，通常以细胞个数／ml表示。检查方法如下： 1）在干净的离心管中加人数滴细胞悬液，再加人6.4％台盼蓝 （trypan blue）1滴，混匀后静置2～3分钟； 2）将计数板（如图）平放在显微镜台上，在盖片边缘加人l～2滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖片间的空间，勿留气泡，勿使盖片漂浮； 3）显微镜下记录计数板四角四个大格中的细胞总数，原则是: 染蓝的细胞不数（死细胞），无色的细胞计数（活细胞），一团细胞按一个细胞计数。 计数时要注意： 如果细胞团数超过10％，说明消化过程进行的不充分； 如果细胞数少于20-50个说明稀释的不当. (二)传代培养 当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展连片，占满器皿表面。 这时需要对其分离重新培养，这一操作过程称之为传代。 有80％～90%或刚刚全部汇合的细胞，是传代的理想时期。 具体方法如下： 1)吸出培养瓶内旧培养液； 2）加人胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底对细胞进行消化； 3）吸出消化液，加人Hanks液，洗去残留的消化液。 4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度； 5）重新接种培养 T-flasks Petri dishes (三)微载体培养（microcarrier culture) 1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。微载体是直径为60-250μm 的微珠。 最初使用的材料为二乙基氨基乙基－交联葡聚糖A－50 后经改进，用带不同基团的葡聚糖（dextran）交联成几种大分子，以利于细胞的贴壁及生长。 目前使用的dextran I、Ⅱ、Ⅲ三种型号都属于交联葡聚糖为基质的微载体，每种微载体所带基团各不相同。 微载体培养细胞的具体步骤 1）选择合适的微载体类型 ●先用少量三种微载体做细胞培养试验，一定时间内计算细胞贴壁数量，比较细胞用量、微载体用量，以此选出适当的微载体。 （2）浸泡水化及消毒 在玻璃容器中加人适量的微载体，加入磷酸缓冲液（PBS）浸泡3小时以上，轻轻搅动。 搅动速度50～70rpm／min为好。 高压蒸汽灭菌， （3）接种 根据细胞类型决定接种浓度，例如，人成纤维细胞的适宜接种浓度为10 cells／微载体；非洲绿猴肾细胞（vero）为5 cells／微载体。 接种要达到一定浓度，但过高也不利。 培养中的搅拌转速： 提供均相培养环境 防止微载体集聚 促进汽液交换 30-120r/min （4）培养观察 显微镜直接观察微载体上细胞生长 将微载体上的细胞消化下来计数并计算其浓度: 取1ml均匀的培养细胞样品，待微载体沉淀后吸去上清液，加PBS液清洗。 加胰蛋白酶37℃消化15min，吸出消化液后加到培养液中，过滤分离微载体，离心弃上清夜，保留细胞沉淀； 加美蓝染液2ml，血球计数器计数，计算细胞浓度。 （5）消化 传代培养或收获细胞均需使细胞脱离微载体，通常采用酶消化法。 （6）分离细胞 脱离微载体的细胞培养液放人容器， 离心沉淀微载体（400r／min，2分钟）收集细胞。 还可用过滤方法，采用直径100μm孔径的尼龙网、不锈钢网等可将细胞与微载体分离开。 （7）传代培养 微载体上分离下来的细胞可进一步做微载体传代培养。 可在细胞脱离微载体后，转接细胞，加人一些新的微载体以增大培养体积。 另一种放大培养方法：也可在微载体长满细胞后直接加人微载体,更换培养基。 (四)微囊化培养（microcapsule culture） 微囊是用一种人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质包裹在其中不能逸出； 细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护。 减少了搅拌对细胞产生的剪切力 由于环境的改善，细胞得到很好的生长，代谢产物浓度增加，纯度提高。 制备动物细胞微囊所用的材料，主要是海藻酸（ALG）和多聚赖氨酸（PLL）. 海藻酸和多聚赖氨酸分子量的大小及其溶液的浓度；细胞与海藻酸钠混合的时间；溶液的pH，温度等都会影响微囊膜直径的大小. 微囊制作 1）分