第三层析技术精要.ppt

 第三章 层析技术 一、概 述 层析（Chromatography）又称为色谱,它利用混合物中各组分的物理、化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附力、分子亲和力等) ，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。 从一个混合物中分离、纯化样品的纯度如何，取决于混合物中各组分K值的差异程度。 混合物中各组分若 K值相差较大, 则较易把混合物中的各样品分离。反之,K值相差较小,则不易分离。 2、塔板理论 在层析分析过程把层析柱划分(想象)为若干个连续部分,每个部分称为一个塔板。 理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。 色谱历史 层析法进行时有两个相组成，一个为固定相(Stationary phase )，另一个为流动相(Mobile phase )。由于各组分所受的在固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。 三、层析技术的分类 (一)按两相所处的物态分类 以液体作为流动相的称为液相层析 以气体作为流动相的称为气相层析 其固定相也可有两种状态: 以固体作为吸附剂的固定相 以涂布在固体表面的液体作为固定相 （二）按固定相形式分类 1、柱层析（colum chromatography） 将固定相装在层析柱中 2、纸层析（paper chrmatography） 纸作为固定相 （三）按层析过程的机制可分类 1、吸附层析(adsorption chromatography ) 利用不同组分吸附能力的不同进行分离 2、分配层析(partition chromatography ) 利用不同组分配系数不同进行分离 3、离子交换层析（ion-exchange chromatography ） 利用离子交换剂与各组分之间的静电力不同 4、凝胶层析（gel chromatography） 利用不同组分之间分子大小不同进行分离 5、亲和层析（affinity chromatography） 利用生物大分子之间特有亲和力的不同进行分离 主要机理是分子筛效应,当被分离物质流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。 将样品加入凝胶柱后,分子大的组份不能进入凝胶中被排阻在外,而分子的小能通过孔隙进入凝胶中。加入洗脱剂后,大分子就随洗脱剂从凝胶颗粒间隙洗脱下来,其流程短流速快,而小分子物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复即流程长,故大分子物质先从柱中流出,小分子物质后流出而得到分离。 大分子不能进入凝胶孔隙中,被排阻在外,受到阻力小,流程短，流速快，先从柱中流出。 小分子进入凝胶孔隙中,阻力大，流程长，流速慢，后从中柱流出 。 三、凝胶层析的数理关系 1、柱床体积(VT) ：即凝胶颗粒的体积以及外部间隙体积的总和。 2、洗脱体积（Ve）：即欲分离物质被洗脱下来所需的洗脱液的体积。 3、外水体积（V0）：即凝胶颗粒间隙水的体积，相应于流动相的体积。 4、 内水体积（Ｖｉ）：即凝胶颗粒内所含水的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。　 5、凝胶颗粒干体积（Ｖｇ） 洗脱体积（Ｖｅ）与Ｖｏ及Ｖｉ之间的关系 Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉ Ｋｄ＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／Ｖｉ Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,在固定相分布为0,全部分布于流动相里而最先流出。 当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的比值为1,而最后流出. 当0 Kd 1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极端行为之间的分子。 ?凝胶层析优点： 1. 凝胶本身不与样品发生化学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和。 3.样品得率高,重复性好。 缺点： 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒