第九动物细胞培养技术精要.ppt

相差显微镜检测：将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间； 荧光染色法：与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst33258，使支原体DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。 细胞接种盖玻片上，未长满前取出玻片，用不含酚红的Hanks液漂洗一下，用1:3醋酸甲醇固定10min 生理盐水漂洗，50?g/ml Hoechst33258中染色10min 染色后用蒸馏水洗1-2min，向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，荧光显微镜观察 支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。 电镜检查：用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。 镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密度颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质，部分种类需要精氨酸、?2或葡萄糖，每一种支原体都有自身特点。 DNA分子杂交检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法较复杂。 4）病毒的污染及检测 滤器对病毒没有任何阻挡作用，通常不容易被污染 病毒不能在细胞外复制 具有宿主细胞的感染限制 检测方式：抗体检测、PCR检测。 5）细胞交叉污染及检测 不容易发生，常见的细胞形态观察可以区分 污染的预防 培养前培养操作时必要的细胞备份对新引进或构建的细胞株应加强观察，并做必要的支原体和病毒的检查。定期消毒培养箱。 培养物的污染防治 挽救细胞：有价值细胞被污染，且污染程度较轻，可通过及时排除污染物挽救细胞 抗生素排除法：冲击法，加入高浓度（常用量5－10倍）抗生素作用24－48小时，再换常规培养液。 加温除菌：支原体耐热性差，将受支原体污染的细胞置于41度中作用5－10小时（最长可达18小时）杀灭支原体。但是41度对细胞本身应有较大影响，故应先进行预试验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。 动物体内接种：细胞接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭掉微生物。 与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并将其消化。用96孔板将培养细胞与巨噬细胞共培养，本方法与抗生素联合应用效果更佳。 1. 细胞生长检测 细胞生长曲线测定--细胞计数法 四唑盐（MTT）比色法 2. 细胞分裂指数 3. 细胞周期 4、培养细胞活力测定 二、培养细胞的生物学鉴定 步骤 取生长良好接近汇合的细胞，胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数。非贴壁细胞，离心，新鲜培养基制成细胞悬液计数。 根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104／mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。 24h后开始计数细胞，每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。 根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）-- 噻唑蓝 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物formazan，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验 操作步骤 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪在490nm处检测各孔OD值记录结果，绘制细胞生长曲线 CCK-8试剂盒 Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）快速灵敏检测水溶性四唑盐，MTT的替代方法， 水溶性四唑盐在电子耦合试剂存在的情况下，被线粒体内脱氢酶还原生成橙黄色formazan。 细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同类细胞，颜色深浅和细胞数目呈良好线性关系。 用于测细胞增殖、细胞存活和细胞毒性。 2、细胞分裂指数 分裂指数：细胞群体中分裂细胞所占百分比，是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 分裂指数—指示体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力。与生长曲线有一定联系，随着分裂指数不断提高，细胞进入指数生长期。 步骤 消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中