第十五酵母基因工程精要.ppt

第十五章 酵母基因工程 第一节 酵母基因工程的发展现状和发展趋势 1974年，2?m质粒。 1977年，酵母基因克隆的蓬勃开展 1978年，酵母和大肠杆菌穿梭质粒 1981年，酿酒酵母表达人干扰素基因 1983年，酵母人工染色体(YAC载体) 1989年，酵母双杂交系统 1996年，酿酒酵母作为第一个真核生物完成了全基因组的测序 一、酵母基因工程的优点 1、真核生物，大多具有较高的安全性； 2、繁殖速度快，能高密度培养； 3、外源基因操作方便； 4、高表达的启动子可诱导调控； 5、翻译后加工和分泌； 6、不会形成不溶性的重组蛋白包含体，易于分离纯化； 7、去起始甲硫氨酸，避免免疫反应； 8、已完成全基因组测序? 二、酵母基因工程的发展现状 1、改造酵母本身用以提高发酵性能； 2、利用酵母作为宿主表达异源蛋白； 3、通过一系列的基因敲除和基因导入改变酵母的代谢途径，从而让酵母产生新的代谢产物。 三、酵母基因工程的发展趋势 1、解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2、在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向 3、利用酵母基因工程筛选更多的新药 4、改造酿酒酵母自身降低生产酒精的成本 5、酵母的生理承受极限研究 6、利用酵母表达膜蛋白 第二节 酵母表达系统 一、酵母表达系统概述 1、酵母表达载体 （1）载体的基本构架 （2）载体的复制形式 附加体型： 2?m质粒：没有选择压力时不稳定。 自主复制序列ARS：有选择压力时，整个群体的平均拷贝数变得很低，难以用于工业生产。 整合型： 同源序列：拷贝数低 rDNA单元：拷贝数高 2、宿 主 （1）安全无毒，不致病 目前已知的酵母菌极大多数是安全的，只有白假丝酵母(Candida albicans)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)等极少数是致病菌或条件致病菌。 （2）遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 （3）构建的载体DNA容易进入，转化频率较高。 （4）发酵周期短，培养条件简单，容易进行高密度发酵。 （5）蛋白质分泌能力良好。 （6）有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。 3、酵母的DNA转化 （1）原生质体法 （2）离子溶液法 （3）一步法 （4）PEG1000法 （5）电穿孔法(electroporation) 二、常用酵母表达系统 1、酿酒酵母表达系统 酿酒酵母基因组数据库 （Saccharomyces Genome Database，SGD） / 免费 整合体型 附加体型 附加体型 整合型 酿酒酵母表达系统的不足： ①较难进行高密度发酵； ②蛋白质的分泌能力较差； ③过度的糖基化。 2、巴斯德毕赤酵母表达系统 优点： ①启动子强并受甲醇严格诱导 ②对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化也更接近高等真核生物甚至人类。 ③甲醇酵母外源蛋白的表达量比酿酒酵母增加了10~100倍。 ④重组菌的遗传性质稳定，表达量和分泌效率高。 ⑤能高密度培养，干细胞量可达100克/升以上。 基因组序列： GS115：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/bogas/ DSMZ 70382： 整合型表达载体 整合位点：组氨醇脱氢酶编码基因HIS4区或AOX1区 启动子：基因AOX1的启动子 选择标记：营养缺陷型，常用HIS4 信号肽序列：酿酒酵母的分泌信号--?交配因子引导序列 受体菌：主要有GS115和KM71，均为HIS4突变型。 （3）转化方式 原生质体法 电激法 氯化锂法 PEG法。 （4）整合方式 1、5ˊAOX1和3ˊAOX1能与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因； 2、染色体AOX1区与载体质粒的AOX1区发生单位点互换； 3、染色体HIS4基因与载体的HIS4基因发生置换。 （5）获得高拷贝整合转化子的方法 1、G418抗性水平筛选高拷贝 2、体外在载体上多次插入目的基因片段 3、宿主rDNA或其他非必需高重复的基因片段同源重组 4、利用基因的功能筛选高拷贝整合 （7）提高外源基因在甲醇酵母中表达的注意事项 ①外源基因中A、T含量，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录； ②密码子是否符合甲醇酵母的偏好性； ③mRNA5’非翻译区的核苷酸序列和长度会影响到核糖体40S亚单位对mRNA的识别； ④选取合适的宿主菌； ⑤产物自身的稳定性； ⑥甲醇酵母液体深层发酵时的培养条件是否合适。 3、酵母表面展示系统 基于a-凝集素的酵母细胞表面展示 基于α-凝集素的酵母细胞表面展示