2012级实验十七十八十九讲义.docx

实验十七 菌种保藏 一、实验目的 1、学习和掌握菌种保藏的基本原理 2、学习几种中期保藏方法 二、实验原理（P266） 微生物是一种资源，如果保存不妥易发生变异，或被其他微生物污染，甚至导致细胞死亡，因此，菌种的长期保藏对任何微生物学工作者都是很重要的，也是非常必要的。 不同的保藏方法虽然原理各异，但其基本原则都是使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态。保藏方法通常基于温度、水分、通气、营养成分和渗透压等方面考虑。主要有以下几种。 传代培养法 斜面冰箱传代保藏； 液体石蜡油法 悬液法 载体法 沙土管法； 麸曲三角瓶法； 滤纸片法 真空干燥法 冷冻干燥法； L-干燥法 冷冻法 低温法：-80~-70℃ 液氮法：196℃ 为降低细胞的冷冻损伤，可用以下途径解决：（1）保护剂；（2）玻璃化。 三、实验器材 1）菌种：A.niger R.oryzae B.subtilus S.cerevisiae S.griseus E. coli 2）M：牛肉膏蛋白胨斜面 豆芽汁斜面 肉汤液 马铃薯斜面 3）试剂：液体石蜡、甘油、河沙、黄土、10%HCl等 4）器具：小试管、冰箱、胶塞等 四、实验步骤 1、短期保藏（斜面、冰箱、保藏）（E.coli） 菌种→接种于适宜斜面→培养→包扎→冰箱保存 （肉汤斜面） （37℃ 48h） （4℃） 2、中期保藏 ① 砂土管法(A.niger R.oryzae B.subtilis) A、河沙处理： 河沙若干＋10%HCl（有机质多则用20% HCl）→加热煮沸30min→倒去盐酸→水洗至中性→蒸馏水洗→烘干→过40目筛→备用 B、土壤处理： 瘦黄土或红土→水洗数次至中性→烘干碾碎→过100目筛→备用 C、砂土混合： 沙∶土＝3∶1→装管（小试管1g/管）→灭菌（0.1MPa，30min）→烘干 D、无菌检查： 10支抽1支→肉汤M→培养（30℃，40h）→无菌→备用 E、菌悬制备： 斜面→2-3ml无菌水洗下菌苔→制成菌悬 F、分装样品： 标记砂土管→加0.5ml菌悬→接种针拌匀 G、干燥： 干燥器干燥→换棉塞为无菌胶塞→蜡封 H、保存：4℃冰箱 ② 液体石蜡（S.griseus S.cerevisiae） A、液体石蜡： 灭菌（0.1MPa，30min）→烘干（40℃ or 110℃）→无菌检查→备用 B、 菌种培养： 接种所保藏菌种于适宜短斜面培养基上，培养出健壮的菌种细胞 C、灌注石蜡油： 无菌条件下，吸取无菌石蜡油注入斜面试管，高出斜面1cm为宜。 D、保藏：直立、低温保藏（4℃） ③ 冷冻低温保藏（-20℃）（E.coli B.subtilis） A、离心收获对数生长中后期的菌体细胞 B、用新鲜M重悬收获细胞 C、加入等体积20%的甘油 D、混匀后，装入冷冻指管或安瓶管中，冷冻保藏 3、注意事项： ① 短期斜面M应为该菌最适M，对于细菌来说，M糖含量要少 ② 砂土管应采用瘦黄土，有机质要少 ③ 石蜡油减少后要及时补充 五、实验结果及讨论 ① 菌种保藏记录 菌种名称保藏编号保藏方法保藏日期存放条件经手人A.nigerB.subtilisS.cerevisiaeS.griseusE.coli②谈谈你对菌种保藏的看法。 实验十八 诱变选育营养缺陷型菌株 一、实验目的 1、学习和掌握紫外诱变的基本方法 2、掌握营养缺陷型突变株的筛选方法 二、实验原理 紫外线(UV)是一种最常用的物理诱变因素，它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的T形成T2聚体，阻碍双链的分开，复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状，因此，为避免光复活，用HV照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后微生物应放在暗处培养。 营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在MM中外源处加该营养物质，才能正常生长的一类突变菌株。在选育中可以依赖其营养要求的特殊性采用逐个检出法，影印培养，限量补充培养法及夹层培养法等方法将其检出。 三、实验材料 1）菌株：E.subtilis 2）M：细菌完全M 细菌基本M（MM）限制M（SM） 3）仪器：培养箱，超净台等 四、实验步骤 1）菌种纯化 斜面→分纯→挑取健壮菌株→出发菌株 2）诱变处理 斜面→2ml无菌水洗下菌苔→20ml/250ml三角瓶肉汤→4ml菌液×3管/组→ （调整浓度在108个/ml） 离心洗涤3次（4ml无菌生理盐水）→重悬在带玻璃珠的三角瓶中→计数（血球计数板） ↓ 取10ml于带磁棒的