重组DNA技术应用要点.ppt

第12章 重组DNA技术的应用 诊断工具 药物生产 基因治疗 重组疫苗 蛋白质工程 代谢工程 1.诊断工具 ——比较序列分析 比较序列分析：单核苷酸多态性（SNP） SNP：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。 利用SNP进行已知遗传疾病的诊断 利用SNP分析未知遗传疾病的原因 建立人类SNP库，利用SNP芯片进行个性化诊断 老年痴呆病对药物tacrine的反应 80％无ApoE4等位基因患者，有疗效 60％有ApoE4等位基因患者，恶化 1.诊断工具——限制性片段长度多态性（RFLP) RFLP是根据不同个体基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同个体的DNA水平的差异（即多态性） 由某些序列重复程度的不同引起的长度多态性变化 主要与卫星DNA序列有关 可以设计多位点探针，分析DNA图谱进行鉴定 2.新药物的生物法生产 一般蛋白质产品必须具有绝对的真实性时（即生物加工的蛋白质产品和天然提取的产品完全一样），选择哺乳动物细胞培养。 真实性意味着不仅所有的氨基酸要有正确的排列顺序，而且在培养细胞中的所有翻译后修饰过程要和在完整的动物体中的翻译后修饰过程相同。 哺乳动物细胞生产的优点： 提供尽可能类似于天然产物的产品，真实性最好 另一个优点是大多数具有商业价值的蛋白质都很容易被细胞分泌出来 转基因植物和植物细胞培养 成本优势 不存在内源病毒或朊病毒的安全问题 生产的放大很容易通过扩大种植面积来实现 选定在植物中无菌的可食用部分生产蛋白质，这样不仅可以避免苛刻的纯化过程，还可以直接将食用部分作为治疗蛋白质口服 通常表达水平非常低（总可溶性蛋白的1％） N-连接糖基化是不完全的，以及缺乏一些其它哺乳动物的翻译后过程。 需要花费大量时间来测试和生产足够的种子，研制生产周期不能令人满意 很难对生长在地里的农作物进行环境控制，因此随着生产时间和生产地点的不同（即环境），产品的生产量（也可能包括质量）变化非常大。 3.基因治疗 对患者细胞中的遗传信息进行修饰来治疗疾病的方法 4. 重组疫苗 失活毒株或活体减毒毒株（有一定危险性） 重组亚单位疫苗（保真度差、无法有效刺激免疫反应） 重组细菌疫苗（接种细菌） 以减毒细菌为宿主表达异源抗原，能够有效刺激免疫反应 重组病毒疫苗（接种病毒） 以病毒为载体表达异源抗原，或破坏毒素基因 植物可食用疫苗（通过转基因植物表达病毒或病菌抗原） DNA疫苗（在宿主中引入编码抗原的DNA分子） 鉴定毒性基因的技术 5.蛋白质工程 氨基酸置换修饰 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。 酶分子的定点突变 1、基因序列分析 2、蛋白质结构分析 3、酶活性中心分析 4、引物设计进行基因定点突变 5、酶基因克隆表达 6、变异特性分析 酶修饰后的性质变化 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶