重组子鉴定与筛选要点.ppt

第8章 重组体鉴定与文库筛选 1. 遗传检测筛选法 2. 限制酶切分析/电泳 3. PCR扩增检测法 4. 核酸杂交检测法 5. 免疫化学检测法 6. 酵母双杂交系统 7. 体外表达筛选技术（ 转译筛选法） 借助抗药性标记基因筛选：如 tet, bla 组织化学法筛选：如lacZ, gusA等 致死基因插入失活: 如sacB等 其他标记基因 ：营养缺陷互补基因、spi等 1. 遗传检测筛选法 2.限制酶切分析+电泳 插入片段的重组载体的分子量比空载体分子量大。 单一位点酶切：1个片段 2位点酶切：2个片段（一般选择克隆位点） 测序鉴定 ★ ★ 从转化后的菌体克隆中提取质粒，酶切后电泳、比较酶切片段的分子量大小。 Marker 空载体 外源 片段 3kb 2kb 4kb 重组 载体 重组 载体 2.6kb载体+1.4kb外源片段 3. PCR扩增检测法 原理： 设计引物扩增外源片段，如果能在模板序列上扩增出预期DNA片段，表明外源片段插入载体或基因组 从重组克隆中提取质粒（或DNA） 用外源DNA插入片段引物作PCR 电泳PCR产物。 检查是否有PCR产物。 PCR产物的长度是否与外源基因一致。 ★ 染色体 染色体 ACTTTGACTCCA TGAAAC G ACTTTGACTCCA TGAAACT marker (1).非探针杂交 异源双链杂交， R-环杂交 4. 核酸杂交检测法 核酸探针：用放射性同位素或荧光基团标记的单链核酸 (2). 探针杂交（用于文库筛选，见基因操作基本技术） Southern blotting Northern blotting 斑点杂交 原位杂交 ★ ☆ 一条DNA异源双链除了单个碱基错配外其余碱基对配对正常，DNA骨架会出现突起,从而错配的碱基可能会旋入DNA双螺旋沟槽中，或者旋到螺旋的外部，或者DNA双链可能会在异源双链处发生曲折。因此，在非变性凝胶中电泳时，具有错配的双链要比没有错的双链移动得慢，从而将突变检出。 异源双链杂交（HA） 如有片段缺失或插入，杂交后还可用电镜直接观察是否有环形的不配对部分 ☆ R-环检测 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，加入作为检测序列的RNA分子，如果DNA中有与RNA互补的序列，则由于DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定而使互补序列的DNA单链被置换出来，形成非常稳定的R-环结构，电镜下可见。 ☆ 利用标记的抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 5.1 放射性抗体检测法 5. 免疫化学检测法 对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 放射免疫测定技术(radioimmunoassay，RIA):用竞争性结合的原理，应用放射性同位素标记抗原(或抗体)，与相应抗体(或抗原)结合，通过原位杂交确定表达抗原或抗体的克隆，也可通过测定抗原-抗体结合物的放射强度确定待测物的浓度。常用于标记的放射性核素有125I，131I，3H 5.2 免疫荧光技术 原理同放射性抗体检测，只是用荧光基团标记来代替放射性核素标记， 常用荧光试剂：罗丹明荧光素、异硫氰酸荧光素等。免疫反应后清洗掉没有结合的荧光标记物，用荧光显微镜进行定性观测，或者用荧光分光光度计进行定量检测。 ★ 放射性抗体检测法过程 5.3 免疫酶技术 原理同放射性抗体检测，只是用酶标记来代替放射性核素标记， 常用酶：辣根过氧化物酶（HPR)，碱性磷酸酶等，需要用酶的底物来处理抗原-抗体结合样品（或膜），如：酶催过程发光，用底片曝光检测。 Ab-E+ Ag——Ab-E-Ag+Ab-E 在抗原反应后，需要先把结合的标记物与游离的标记物分离，然后测定结合 的标记物（或游离标记物）的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。 在抗原抗体反应后，结合的标记物失去活力，不需要分离结合的标记物和游离的标记物就可以测定Ag含量，这种方法称为均相法。 　　常用的免疫酶测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤，这种技术被称为EL1SA （enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附试验)，属于异相法。 ★ ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中(含有聚苯乙烯固相载体，非特异性吸附抗原或抗体），干燥后就被固定在孔底。 孔底 抗原分子表面与抗体特异性结合的化学基团称为抗原决定簇 ★ 加入一抗，反