2-DNA片段扩增及DNA连接-PCR讲解.ppt

PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点 引物设计软件介绍： Primer Premier 5.0 顾名思义，该软件就是用来进行引物设计的。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动有哪些信誉好的足球投注网站引物，并将引物分析结果显示出来。而且进行这些操作非常简单 Oligo 6.57 引物分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列二级结构。 Primer DSigner 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。 四． PCR反应注意事项 Optimization of PCR condition ＊ PCR方法操作简便， 但影响因素颇多。 去离子水（补足反应体系） 39 ?l 模板 2 ?l 10?PCR buffer（含MgCl2） 5 ?l dNTPs 10mmol/L 1 ?l 5’引物 sense 10?mol/L 0.5~1 ?l 3’引物 anti-sense 10?mol/L 0.5~1 ?l Taq DNA pol. 2U/?l 1 ?l 轻弹管底混合（用离心机甩一下） （一）、PCR反应体系 ----- final volume 50?l 加各种成分 最好 在冰上进行。 1. 模板 DNA 不是越多越好 ： 2 ?l 1 在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高， 2 但模板浓度过高会导致引物无法与模板结合，反应的非特异性增加。 3 一般采用102?105拷贝的待扩增片段作为模板: 微克水平的基因组DNA、重组质粒DNA用ng水平的量。 4 模板过多还能大量消耗镁离子。 The amount of template—“more is less”. Don’t add too much template Template DNA 不能含有其提取时所用试剂： 提取genomic DNA 的基本过程： （1）裂解细胞，消化蛋白质，抑制DNase activity proteinase K＋SDS＋EDTA （2）然后用酚－氯仿多次抽提，去除蛋白质 （3）用RNase去除RNA （4）用乙醇沉淀DNA，air dry, 无菌水溶解。 2. 引物 ： 0.5 ?l Primer 1: OD 5 PCR 反应引物浓度为0.1~0.5μmol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。 如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。 但引物浓度太高， （1）会增大引物结合到不严格配对区域的机会，这样的错配会导致非特异性产物的扩增; （2）可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。 但如果该比例太低，PCR效率也会降低。 primers 引物的配制 Primer 1: OD 5 注意： 冻干品，计算一管引物的总含量或克分子数 先配成100mM的浓度作为储存液 工作液: 10?mol/L, - 20℃保存。 50 ?l反应体系中加：0.5～1 ?l, 终浓度：0.1~0.5 ?mol/L 如果需要反复应用的引物，配制后一定要分装保存，一段时间后弃掉。 切记： 不要将合成回来的引物一次性配成工作液！ primers RT的引物选择： Oligo dT 15-18 Specific anti-sense primer Random primer 因为基因序列与mRNA序列是一致的。 病毒RNA作为RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链RNA病毒？ 正链RNA病毒：RT引物用anti-sense primer； 负链RNA病毒：RT引物用sense primer。 Thermostable DNA polymerase 3. DNA聚合酶 活 性： 5`--3`方向的聚合酶活性。 在75~80℃具有最高的聚合酶活性。 半衰期：95℃ ，40分钟 缺乏3`--5`外切酶活性。 因此没有校正功能。 Fidelity（保真度）：PCR反应的错配率一般为1~2X10-4 An e