2013免疫试验理论答案_18770.docVIP

1.杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理、主要流程？ 原理：杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，即成为能够分泌抗体并能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过克隆后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。 流程：免疫小鼠（融合前3-4周）→强化免疫（融合前3-4天）→取脾细胞制成悬液（融合当天） 骨髓瘤细胞→融合前2周复苏培养→收集呈指数生长细胞 融合（PEG）→ 加饲养细胞（融合当天或前一天） →在细胞培养板，HAT培养液中培养→融合前两周改用HT培养液培养（维持1-2周）→检测抗体（融合后第10、14、18天）→阳性孔细胞，初次克隆化（加饲养细胞）→检测抗体（克隆化后10、14天），多次克隆化→阳性杂交瘤细胞在24孔培养板中扩大培养4-7天→在培养瓶中扩大培养一周以上→1收集培养上清→鉴定；2杂交瘤细胞冻存液氮中；3杂交瘤细胞注入小鼠腹腔→收集腹水→提纯抗体并鉴定 细胞类型 正常培养基 HAT培养基 正常培养细胞 + + TK缺陷细胞 + - HGPRT缺陷细胞 + - 杂交瘤细胞 + + 为什么只有杂交瘤细胞能在HAT选择培养基中生长？ 细胞的DNA生物合成有两条途径：一条是生物合成的主要途径：即由氨基酸及其小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，在这一合成途径中，叶酸作为重要的辅酶；另一途径为辅助途径，以次黄嘌呤和胸腺嘧啶为原料，在次黄嘌呤-鸟嘌呤核苷酸转换酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的催化作用下合成DNA。HAT培养基中含有氨基蝶呤（为叶酸拮抗剂），故所有细胞的DNA主要合成途径均被阻断，只能通过辅助进行DNA的合成。HGPRT缺陷型或TK缺陷型的骨髓瘤细胞在HAT培养基中因不能通过旁路合成DNA而死亡。脾细胞虽有HGPRT或TK，但不能再体外长期培养繁殖，一般在两周内死亡。而杂交瘤细胞因从脾细胞获得HGPRT或TK，可通过旁路合成DNA，同时又具备肿瘤细胞的特点，在体外培养中可以长期繁殖生长。所以- ELISA常见的方法类型有几种？分别举例说明其检测原理和临床应用。 一、测定抗原的方法 1.竞争法：首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合物（测定管），而另一组只加酶标记抗原（对照管），再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的位置抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需要较多量的酶标记抗原为其缺点。 2.双抗体夹心法：首先用特异性抗体包被与固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待测样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为待测抗原的量。这种方法待测的抗原必须至少有两个可以与抗体结合的部位（二价或二价以上抗原），因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。 3.双位点一步法：在双抗体夹心法的基础上，进一步发展了双位点一步法。测定时将受检标本与酶标抗体同时加入进行反应，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。该法简便、省时，但当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应。 二、测定抗体方法： 1.间接法：首先用抗原包被于固相载体，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色，底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分光光度计定量测定，本法的优点是只要变换包被抗原，就可用同一种酶标记抗人球蛋白，进行多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断，具有更广的通用性。其成功的关键在于抗原的纯度，另一干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。 2.竞争法：当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体越少，因此阳性反应浅于阴性反应。 3.捕获法：先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。在与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。 为何常用密度1.077±0.001的分层液分离人外