DNA重组.教程分析.ppt

分子生物学教研室文建雷 被整合到细胞基因组中的逆转录病毒序列称为原病毒(Provirus)，一个原病毒就作为细胞基因组的一部分。有时细胞的序列能与逆转录病毒的序列重组并且随之转座，这些序列可能以双螺旋形式插入到基因组的新位点。被逆转录病毒转座的细胞序列能改变被感染细胞的特性。 分子生物学教研室文建雷 逆转录酶在宿主细胞中将RNA逆转录成双链DNA（DNA也能被逆转录成环形的，但环形DNA不能进行复制）。线形DNA进入到细胞核中，一个或多个DNA分子在整合酶(Integrase)催化下被整合到宿主基因组中，整合的原病毒被宿主的转录系统转录为病毒RNA，这个RNA既能充当mRNA也能作为基因组被包装成为病毒。整合作为病毒生命周期的一部分是转录所必需的。逆转录酶和整合酶是由病毒基因组编码的。 分子生物学教研室文建雷 gag编码核心蛋白，pol编码逆转录酶和整合酶，env编码外壳蛋白 分子生物学教研室文建雷 病毒的RNA在末端有同向重复序列(Direct repeat)，紧挨5’端的是80~100nt的U5区。在3’端前是170~1350nt的U3区。DR片段在将RNA逆转录为DNA时被用来产生大量的同向重复序列，这些重复序列能在线形DNA找到，在整合的形式DNA中两端各缺少2bp，是由整合的机制造成的。 分子生物学教研室文建雷 分子生物学教研室文建雷 整合原病毒的形式是线形DNA，DNA两端序列都是“U3-R-U5”，称为LTR（long terminal repeat，长的末端重复序列）。 并且，U5的3′端和U3的5′端由一个短的IR组成，因此LTR本身的两个末端都有反向重复序列。 分子生物学教研室文建雷 4.4.6.1 逆转座子 整合的原病毒DNA与转座子(Transposon)类似，原病毒末端有短反向重复序列，其两端有靶DNA的正向重复序列。 原病毒是有直接将其线形DNA序列插入靶位点产生。与转座子情况类似，病毒DNA的末端很重要，末端突变能阻止其整合。 分子生物学教研室文建雷 最保守的特点是紧靠反向重复处存在二核苷酸CA。整合酶把线形DNA末端与一个核糖核蛋白质复合物结合，并切除保守CA以后的碱基，把平末端转变成凹末端。 靶位点是随机在序列上选择的，整合酶在靶位点上交错切口，靶DNA被切除的5’端和病毒DNA的3’凹陷末端共价连接。病毒DNA一条链的两个末端先被连到靶DNA上，随后单链区被宿主的酶所修复。 分子生物学教研室文建雷 分子生物学教研室文建雷 在此过程中，病毒DNA 5’端的两个突出碱基被去除。结果使被整合的病毒DNA在每个LTR序列上丢失两个碱基，这就是5’U3左端和3’U5右端丢失2bp的机制。 在被整合的逆转录病毒基因组每个末端都存在一个靶DNA的特征短同向重复序列。 分子生物学教研室文建雷 每个LTR的U3区携带一个启动子。左边LTR的启动子负责起始转录原病毒。启动子实际上是由RNA到双链DNA转化所形成的。 分子生物学教研室文建雷 4.4.6.2 酵母的Ty元件 Ty（transponson yeast，酵母转座子）是由分散的DNA重复序列家族组成，在不同品系的酵母中它们所处的位点不同。 转座后在插入的Ty两端靶基因产生5bp正向重复。Ty的转座效率为10-7～10-8，低于细菌转座子。 在不同Ty元件之间有很大的不同。大部分元件属于两个大家族。被称为Ty1和Ty917。 分子生物学教研室文建雷 每个元件长6.3kb，其末端是330bp同向重复序列，称为δ。各种类型中的每个Ty元件都有一定的差异，包括碱基对的替代、插入和缺失。在一个典型的酵母基因组中有约30个拷贝的Ty1型和约6个Ty917型元件。另外还有约100个独立的δ元件，称为单独δs。 分子生物学教研室文建雷 分子生物学教研室文建雷 Ty元件可被转录成2种带有poly(A)+的RNA，其含量占单倍酵母细胞总mRNA的5%以上。这两种RNA的转录都是在左边δ元件内的启动子中起始，一个在5kb之后终止；另一个在5.7kb后终止，终止子位于右端的δ序列内。 分子生物学教研室文建雷 Ty序列有两个同向的开放阅读框，这两个阅读框有13个氨基酸的重叠。TyA序列编码一个DNA结合蛋白质。TyB含有与逆转录病毒的逆转录酶、蛋白酶和整合酶基因同源的序列。 分子生物学教研室文建雷 TyA和TyB的结构和功能与逆转录病毒的gag和pol相似。 TyA和TyB是在两种阅读框中表达。TyA蛋白由TyA读框编码，在其末端终止。但TyB读框仅表达成为连接蛋白的一部分。通过特殊的移码通读终止密码，将TyA区域和TyB区域融合在一起。 分子生物学教研室文建雷 Ty元件的重组似乎是爆发式发生，当一个发生重组会引起一系列重组。在Ty元件之间的基因改变发生在不同的位点，结果导致一个