打破DNA的物种界限——基因工程.教程分析.ppt

基因重组（genetic recombination） 指一段DNA在细胞内或细胞间，甚至在不同个体或物种之间进行交换，并能在新的位置上复制或转录，乃至翻译。 17.1 基因的天然重组 17.1.1 接合作用(conjugation)  　 　 17.1.4 位点特异重组 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 特点：在供体与受体的特定位点的短同源序列之间，DNA精确切割， 连接。 DNA不丢失、不合成、不交换对等部分（有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，又称整合式重组），需要位点专一性的蛋白质因子参与。 同源重组的Holliday模型 ①两个同源染色体DNA排列整齐； ②一个DNA的一条链断裂，并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体(holliday junction)； ③通过分支移动(branch migration)产生异源双链DNA (heteroduplex DNA)； ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant) 同源重组的生物学意义 维持种群的遗传多样性。 有助于DNA的损伤修复。 有助于真核细胞减数分裂染色体正确分离。 为基因打靶技术和基因敲除/敲入动物模型的建立奠定了理论基础。 基因敲除（gene knockout）：利用同源重组原理，有目的地去除（敲除）实验动物体内某特定基因的技术，以用于观察目的基因的功能。 构建同源重组载体； 导入胚胎干细胞（embryo stem cells，ES）； 通过同源重组敲除原有基因； 将敲除成功的ES细胞转入小鼠囊胚（blastocyst）中参与胚胎发育； 合理培育，筛选出两个等位基因都被敲除的纯合子小鼠； 观察、研究小鼠的表型变化。 17.2 基因的人工重组 （2）基因工程的诞生（1972—1976年） 20世纪70年代初，人们发现了限制性核酸内切酶、DNA连接酶和可作为基因工程载体的细菌质粒，使基因工程从理论走向实践。 1972年：Berg 用EcoRⅠ分别酶切猿猴病毒SV40 DNA和λ噬菌体DNA并用连接酶将之连接起来, 第一个重组DNA分子诞生。 1973年：Cohen将酶切的DNA分子与质粒连接，并将其转化入E.coli。 至1976年：相关科学家完成了DNA重组相关的载体与受体细胞的安全性改造。 （3）基因工程技术的成熟（1977-1980) 1977年，Itakura等人首次在大肠杆菌中表达了人的生长抑素基因；Ullrich等人克隆并表达了人的胰岛素基因。 1978年，美国Genetech公司开发出重组大肠杆菌合成人胰岛素的生产工艺，拉开了基因工程产业化的序幕。 （4）基因工程技术的腾飞（1980-至今) 1982年：转基因小鼠。 1983年：转基因植物技术的建立。 1990年：基因治疗技术用于临床。 1991年：人类基因组计划正式启动。 1996年：体细胞克隆羊Dolly诞生。 17.2.2 基因工程技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 末端转移酶 DNA连接酶 多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 3）可变酶 所识别的序列中有一个或几个碱基是可变的（通常用N表示），并且识别序列往往超过6个核苷酸。例如： BstpⅠ识别序列为GGTNACC，其中有 1个可变碱基； BglⅠ识别序列为GCCNNNNNGGC，其中有5个可变碱基。 4）能识别和切割甲基化序列的酶 例如，DpnⅠ可识别和切割甲基化序列GATC（其中的A被甲基化后才能被该酶识别和切割）。 5)具有星号活性的酶 17.2.2.2 DNA聚合酶 可将脱氧核糖核酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸聚合。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I，DNA polⅠ） 是由大肠杆菌pol A基因编码的一种单链多肽，具有5′→3′聚合酶活性、5′→3′和3′→5′核酸外切酶活性。DNA polⅠ的5′→3′聚合酶活性和5′→3′核酸外切酶活性协同作用，可催化DNA链发生缺口平移（nick translation）反应，因而常用于DNA探针的标记。 （2）Klenow片段 功能：具有5 ′→ 3 ′聚合酶的活性以及3 ′→ 5 ′核酸外切酶的活性。 作用： 补平限制酶消化DNA形成的3 ′末端； DNA分