蛋白质组学在鼻咽癌临床分型的应用教程分析.doc

蛋白质组学技术及其在鼻咽癌临床分型研究中的应用 陈 艳，田道法 （湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410007） 摘要：　蛋白质组学技术的应用日益广泛，并在向临床实际应用发展，包括临床标本的检测性研究及相关疾病的诊断与分型等。本文对于蛋白质组学技术及其在鼻咽癌临床分型研究中的应用情况进行综述，以介绍并推进该类技术在肿瘤临床上的应用。 鼻咽癌是来源于鼻咽上皮组织的恶性肿瘤，其死亡率约占全部恶性肿瘤死亡率的2.81％，居第八位；在头颈部恶性肿瘤中，鼻咽癌的发病率则居首位。早期转移是鼻咽癌的显著临床特征之一，是由鼻咽癌细胞的特殊生物学特性所决定的，是造成患者病情恶化的主要原因。尽管人们一直在探索鼻咽癌的发病机制，但鼻咽癌的发病机制还不十分清楚。大量的研究结果表明[2-3]，肿瘤的发生发展是多基因参与、多阶段发展的病理过程,涉及大量不同种类和性质蛋白质的功能活性。肿瘤发生发展过程中,细胞恶变前后的蛋白质组表达情况发生了非常复杂的变化，普通生化分析技术很难把握其全貌。应用蛋白质组学研究技术分析比较肿瘤发生过程中的蛋白质组变化,就可以比较全面地分析某一时间断面相关蛋白质总体变化趋势，有利于发现肿瘤相关特异性蛋白质,不仅为肿瘤诊断提供分子标志,也可能为肿瘤的治疗和药物开发提供可靠靶标。 蛋白质组是指某一物种、个体、器官、组织或者细胞基因组的全部蛋白质产物的表达谱，或称一种细胞内存在的全部蛋白质。澳大利亚的两位学者Wilkins和Williams在1994年首先提出了蛋白质组(proteome)的概念，即基因组所表达的全部蛋白质，是细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。蛋白质组学(proteomics)是研究细胞内全部蛋白质的组成及其规律的科学。 蛋白质组学研究已广泛应用于肿瘤生物学标记物的筛选和鉴定、肿瘤分类、治疗及肿瘤发生机制等领域。利用功能蛋白质资料，可以解释肿瘤的癌变机理，且对筛查可疑病例、早期诊断、病情监测、预后评估具有很大的临床意义。比较正常细胞与疾病细胞之间的差异表达蛋白质谱，寻找与疾病发生发展相关的关键蛋白质，有助于深人探讨疾病的发生机制；通过质谱分析等技术确认差异蛋白质，可以为疾病提供早期诊断标志物。 一．蛋白质组学技术 蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析, 通过对某一物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质生物学特性(包括表达水平、结构、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质相互作用) 的研究, 可以对蛋白质所执行的生理性、病理性活动作出精细、准确、本质性的阐述[4]。蛋白质组学最有价值的优势，是它可以在一个实验中观察一个完整的蛋白质或蛋白质亚型在特定的时间下, 其生理或病理状态中所发生的相应的变化[5]。蛋白质组学的研究内容包括: ① 针对已知基因及转录数据库的生物体、组织及细胞, 建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库(蛋白质表达谱) 及其蛋白质组连锁群; 识别执行关键生命功能的多种蛋白质复合物并分析控制这些多蛋白质复合物的基因调控网络的特征; ②以重要的生命过程或人类一些重大疾病为对象, 进行重要的生理和病理体系或过程的研究, 即比较蛋白质组学研究；③ 蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。 蛋白质组学研究的一般过程，首先是获取细胞或组织样品，然后进行样品制备；通过二维凝胶电泳(2D—PAGE)对样品蛋白质进行大规模的群体分离，借助计算机辅助分析软件，确认2D—PAGE图谱上的差异表达蛋白质；继而利用准确的切取技术，获得2DE胶上感兴趣的差异蛋白质斑点，再对此凝胶块进行酶解消化，分离纯化蛋白质，在质谱仪上进行质谱分析，获得肽指纹图及其相关数据；然后进行数据库检索，对蛋白质种类及相关理化特性和功能活性进行鉴定；最后分析蛋白质在细胞与组织中的表达及其生物学意义。 常用样品来源有：体外培养细胞、活体组织标本、血清和体液等等。 样品制备与蛋白质分离：双向凝胶电泳2-DE于1975年由O’farrll等[6]创立，主要应用于蛋白质的大规模分离。2D主要过程包括样品制备、水化与等电聚焦、胶条的平衡及SDS等步骤。其基本原理，是先从组织和细胞中获得蛋白质，通过pH梯度(immobilized pH gradient)凝胶电泳，根据蛋白质电荷差异分离出不同pI值的蛋白质条带，再将此胶条经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，按蛋白质分子质量大小而加以分离。固相pH梯度凝胶电泳技术的发展，使得2-DE的稳定性和可重复性得到明显改善[7]。 SDS运行结束后，蛋白质样品经过双向电泳而得以分离，然后就要凝胶进行染色，再于凝胶图象分析仪上进行蛋白质分离结果的分析。常用染色方法有考马斯亮蓝染色、银染色。染色完毕后，利用计算机软件对2-DE凝胶图像进行分析，如PD-QUEST软件、LIPS、HERMES、GEMIN