微量凯氏定氮法测定蛋白质含量教程分析.docx

微量凯氏定氮法测定蛋白质含量 姓名：葛照硕 【摘要】蛋白质（protein）是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。蛋白质是食品中重要的营养指标。各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。 本实验采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量。 【关键词】微量凯氏定氮法 微量凯氏定氮仪 蛋白质含量 前言 1、蛋白质含量测量方法 从查阅的资料来看，目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（ Bradford）、Folin酚试剂法。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。生物材料的含氮化合物分析测定主要是指蛋白质，核酸的含量通常是用定磷法或别的方法测定。蛋白质的含氮量几乎是恒定的，约在15~16 %之间。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 双缩脲法(Biuret) 双缩脲(NH3CONHCONH3 ) 是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。 Folin酚试剂法 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此，反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg 考马斯亮蓝法（ Bradford） Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm, 蛋白质在1～1 000 μg 范围内, 蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。 紫外吸收法 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm 处,其吸光度(即光密度值) 与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 2、凯氏定氮仪 凯氏定氮仪是根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器。因其蛋白质含量测量计算的方法叫做凯氏定氮法，故被称为凯氏定氮仪，又名定氮仪、 HYPERLINK /view/859803.htm \t _blank 蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪。 图1 改良式凯氏定氮仪 1,2,3 弹簧夹，4 加样漏斗，5 进气口，6 反应室，7 夹套，8 冷凝管，9 出水口，10 进水口 实验目的 1、学习微量凯氏定氮法的原理。 2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等）。 实验原理 当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素转变成CO2和H2O，而氮元素转变成氨，并进一步与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为“消化”。消化时分解反应进行得很慢，需要加入硫酸钾以提高沸点（可由290℃提高到400℃），加入硫酸铜作为催化剂（其他氧化剂如H2O2也可）。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解放出氨。用水蒸气蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸（硼酸）溶液中，然后用标准盐酸溶液进行滴定，从而计算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下： 本法适用范围为0.2~1.0 mg氮，相对