库克耐酸耐热菌检测方法.doc

耐酸耐热菌（库克）的检测方法 1 适用范围 本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。 2 仪器和试剂 2.1 恒温水浴：80±1℃。 2.2 恒温培养箱：40±1℃。 2.3 灭菌培养皿：直径为90mm。 2.4 灭菌试管：18×180mm。 2.5 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。 2.6 酵母粉。 2.7 蛋白胨。 2.8 琼脂粉。 2.9 葡萄糖。 2.10 吐温80。 2.11 12.5%苹果酸。 2.12 灭菌蒸馏水。 2.13 K氏培养基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸馏水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g琼脂粉、0.5g 葡萄糖和0.5ml吐温80，使其溶解，轻轻盖上三角瓶的盖子，在121℃灭菌25分钟；在一个小烧杯中加入10ml蒸馏水和1.25克的苹果酸，搅拌直至溶解，将苹果酸的水溶液用0.45um的滤膜过滤，将处理过的苹果酸水溶液加入到灭菌的K氏培养基中，搅拌均匀，使其pH值达到3.7±0.1。当冷却到大约50℃时，将K氏培养基倾注到培养皿中，凝固后在0-5℃的冰箱中储存，有效期60天，并记录配制日期。 3 操作步骤 3.1 样品处理 3.1.1 浓缩清汁： 打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作，取10ml浓缩清汁于15ml灭菌的试管中，再移取10ml浓缩清汁于另一带有温度计的15mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到80±1℃，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，用90-100ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤。 3.1.2 清汁、水： 打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作，取150ml清汁（或水）于已灭过菌的玻璃样品瓶中，再移取150ml清汁（或水）于另一带有温度计的玻璃样品瓶中，作为温度控制用，盖上样品瓶的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到80±1℃，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。将热处理过的样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。 3.1.3 浊汁： 打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作,取20ml浊汁于已灭过菌的试管中,再移取20ml浊汁于另一带有温度计的20mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中,当温度达到80±1℃时,开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，将热处理的样品用0.45um的滤膜真空过滤。 3.2 培养及计数 取掉过滤器的上部装置，用灭菌的镊子，将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上，轻敲数次，以保证滤膜与培养基接触。倒置于40-41℃恒温培养箱中，在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子，以调整恒温培养箱的湿度，培养5天。培养结束后，记录该培养温度下滤膜上的菌落数。 根据对样品的污染情况，可选择稀释度。用灭菌吸管吸取25ml样品，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：10的稀释度；用灭菌吸管吸取1：10的稀释液25ml，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：100的稀释度，稀释后的样品的检测方法同上。培养结束后，记录滤膜上的菌落数，并按相应的稀释度进行计算。 4 数据处理 结果报告10ml的浓缩清汁样品中含有的菌落数,报告单位为cfu/10ml。 结果报告150ml的清汁（或水）样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/150ml。 结果报告20ml的浊汁样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/20ml。 参考资料：库克实验室耐热耐酸菌的检测方法。 NDM耐酸耐热菌检验 1 适用范围 本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。 2 仪器和试剂 2.1 恒温水浴锅：70±1℃ 2.2 恒温培养箱：45±1℃。 2.3 灭菌培养皿：直径为90mm。 2.4 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。 2.5 灭菌三角瓶：500ml。 2.6 灭菌蒸馏水。 2.7 YSG培养基的配制： A组： 酵母粉（MERCK）： 2.0g 葡萄糖： 1.0g 可溶性淀粉(MERCK)： 2.0g 蒸馏水： 500ml 把A组用1-2N硫酸或盐酸调至PH为3.7±0.1； B组： 琼脂（MERCK）： 15.0g 蒸馏水： 500ml 把A组和B组分别在121℃ 15分钟条件下灭菌，冷却至50—60℃，把两者混合。 3 操作步骤 3.1 取样品50ml于一个无菌瓶中，另取同样品同体积于一个相同的瓶中做