03NO对大鼠心肌缺血预处理影响和再缺血预处理中作用03.doc

一．实验名称：NO对大鼠心肌缺血-再灌注的影响和缺血预处理中的作用 二．实验目的：学习心脏缺血再灌注模型的建立 探究NO对心脏缺血-再灌注损伤（IRI）的影响及其在缺血预处理（IP）保护机制中的作用 三．实验原理：缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）的发生机制尚未完全阐明，近些年来，国内外学者对NO的研究较多，NO是一种具有很多生物活性的小分子物质，参与许多病理和生理过程，其中涉及缺血再灌注损伤。缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）可明显减轻之后的缺血-再灌注损伤，但机制也尚未明确，已知在缺血预处理中会释放一些内源性保护介质：腺苷，缓激肽，乙酰胆碱等，三者均可促进内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)诱导NO的合成，提示NO可能参与了缺血预处理，但机制未明。目前，多数研究认为，缺血-再灌注的损伤与NO的生成减少有关，NO对心肌再灌注有保护作用；但另有研究发现，给予一氧化氮合酶抑制剂（NOS）,如：L-NAME等,来减少NO的生成，并未使再灌注损伤加重，甚至改善心脏功能。 为进一步阐明NO的作用，我们设计并进行此项实验。 四．实验材料： 1.实验对象：健康雄性大鼠12只，体重250±20g 2.实验器材和药品：计算机生物信号采集处理系统心电输入线cm、直径0.5-0.8mm）、小动物手术台、哺乳类动物手术器械（开胸器、外科手术剪、手术钳等）、 三通管、动脉夹、铁支架、 注射器（1 ml，2 ml，5ml）、20%乌拉坦、0.3%肝素生理盐水、生理盐水、L-精氨酸、L-NAME、手术结扎线，充气乳胶管等 五．实验方法： 1.大鼠称重， 20%乌拉坦（5ml/kg）进行腹腔注射麻醉，固定，剪去手术区域体毛，以0.3%肝素股静脉注入作抗凝处理。 2. 颈部正中切口，游离右侧总动脉及气管，分别在下方穿线备用，分离右侧颈总脉1～1.5厘米，近心端用动脉夹夹闭，远心端用线扎牢，在结扎处稍下剪一斜口，向心脏方向插入带三通管的心脏导管（导管内预先充满肝素溶液），导管尾端与压力换能器相接并连于计算机信号处理系统 3.气管插管，接入呼吸机，进行人工呼吸。 4. ？连接心电图机，（连在哪里的？）选用标准肢体导联。对大鼠进行心电图检测，记录导联心电图30s。（如有异常者，弃之。）心电信号接BL420-F计算机信号处理系统 5．打开胸腔，并固定。充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，结扎冠状动脉前降支，结扎之前在预结扎的冠状动脉前降支处放置一根约长0.5cm、直径1.5mm的乳胶管，打一个活结结扎，以备进行反复多次缺血再灌实验。 或者经左颈总动脉插管至左心室，接压力换能器测试内压，开胸选取冠脉左前降支起始端，以7-0无创伤缝合针线进行结扎，打一活结，拉紧丝线造成缺血状态，松开丝线可恢复再灌注。 6.术毕稳定20min。随机分入各组进行实验。 7．将12只大鼠分成6组，每组两只，分别为 ①IR组 ②IR+L-精氨酸组 ③IR+L-NAME组 ④IP组 ⑤IP+L-精氨酸组 ⑥IP+L-NAME组 8.分别于缺血前25min和10min两次给予①、②、③组生理盐水1ml、L-arg300mg/kg、L-NAME13mg/kg，再进行30min缺血和1h再灌注。 9.以两次5min缺血+10min再灌注作为缺血预处理，其中：每次的10min再灌注前按步骤8给予相应组生理盐水，L-arg和L-NAME，再进行30min缺血和1h再灌注。 10．观测指标：心率、血压、左心室内压（LVSP）、左心室舒张末期压力（LVEDP） 六．实验结果 心率 BP LVEP LVEDP ±dp/dtmax 七．统计学分析 所有数据均以均数±标准差表示 组间比较利用单因素方差分析 两两比较用t检验 八．预期结果 L- arg组和L- NAME组均明显减轻了IR引起的损伤。缺血预处理前给予NO前体L- arg增加NO生成或使用L- NAME阻断NO生成对缺血预处理保护作用无明显影响。 九．说明的问题： 1.IR+L- arg组，缺血再灌前给予L-精氨酸可增加内源性NO生成可对心肌缺血再灌注发挥保护作用； 2.IR+L- NAME组，缺血再灌前给予L-NAME可能通过减少NO来减少再灌注时其ONOO-的生成，因而减轻心肌损伤和凋亡。虽然也会因NO量减少而加重损伤，但后者的影响将小于前者的保护，提示再灌时期的NO对心脏是不利的。 3.IP所有组因有缺血预处理而之间变化不大，提示NO可能没有参与缺血前处理，NO对心脏的保护可能与缺血预处理关系不大。