PRRSV经典株与Nsp2变异株RTPCR鉴别诊断方法标准操作规程.doc

PRRSV经典株与Nsp2变异株RT-PCR鉴别诊断方法的标准操作规程（检验SOP） 1．适用范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）经典毒株与Nsp2基因缺失株的特异性逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）区分技术。 本标准适用于疑似感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪的组织、血液及其他病料样品。 2. 试剂 2.1 天根公司TIANamp Virus RNA Kit 病毒RNA提取试剂盒目录号：DP315-R 2.2 赛百盛公司 goldview 2.3 天根公司Quant One Step RT-PCR Kit目录号：KR113公司 2.4 琼脂糖 2.5 分析纯酒精（99.7%） 2.6 6×DNA电泳Loading Buffer 3．实验室条件 3.1仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外仪、微量移液器、水浴箱等。 3.2从事PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出DNA提取区、基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。4. 试剂的准备 4.1 扩增PRRSV的引物：PRRSV P1、PRRSV P2、PRRSV LOW。 4.2 1.5%琼脂糖凝胶加入0.1% goldview 4.3 1×TAE缓冲液 4.4 goldview 4.5灭菌超纯水 4.6 DNA分子量标准（Marker DL1000） 5. 操作步骤 5.1 样品处理 处理材料： a. 材料为发病猪只血液、血清或淋巴液可直接吸取140μL。 b. 材料为细胞上清液，可直接使用140μL新鲜上清混匀。 c. 材料为贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，反复冻融三次，然后3000r/min离心5min，取上清液140μL。 d．材料为病猪肺脏、淋巴结、扁桃体等病料样品时，需要先用生理盐水或PBS进行研磨，收集研磨物后反复冻融3次，12 000r/min离心10min，取上清140μL。 5.2 用移液器将560μL Carrier RNA工作液（为裂解液RL与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法如附录配液表配制）加入一个干净的1.5mL离心管中。 注意：如果样本体积大于140μL，可等比例增加工作溶液和无水乙醇的用量。 5.3 向离心管中加入140μL检测样品（样品需平衡至室温），涡旋振荡15秒混匀。 注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA 工作液需要彻底混匀。 5.4 在室温（15-25℃）孵育10分钟。 5.5 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。 5.6 加入560μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒。 注意：如果周围环境高于25℃, 乙醇需要在冰上预冷后再加入。 5.7 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。 5.8 仔细将离心管中的630μL液体转移至RNase-free吸附柱CR2（吸附柱放在2mL收集管中），盖上管盖，6000×g（8000rpm）离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。 注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中，如为组织苗，在过柱前请离心后将上清液过柱。 5.9 重复此步骤7。 5.10 小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，6000×g（8000rpm）离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。 5.11 小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，6000×g （8000rpm）离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。 5.12 将吸附柱放回收集管中，13,400×g （12,000rpm）离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液。 注意：乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。 5.13 可选步骤：将吸附柱放回2mL收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干。 5.14 将吸附柱放入一个RNase-free 超净离心管（1.5mL）中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入60μL RNase-free ddH2O，盖上盖子，室温放置5分钟。6000×g （8000rpm）离心1分钟。 5.15 可选步骤：将上一步骤的洗脱液再次加入膜中央，并6000×g （8000rpm）离心1分钟，以增强RNA洗脱效果。 注意：确保洗脱液（RNase-free ddH2O）在室温平衡后再使用。如果加入洗脱液的体积很小（小于50