RNA提取和cDNA合成原理和实验方法.doc

RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法 原文地址:/biotech/exp/molbio/RNA/2011/html 经常会有人问RNA如何提取？总RNA的提方法为异硫氰酸胍-酚-氯仿 一步法，如下： TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍（试剂）和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 第一节 概 述 　　从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。　　一、RNA制备　　模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。　　细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 　　二、cDNA第一链的合成　　所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。 　　AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。　　三、cD