苯丙氨酸解氨酶纯化及活性测定.doc

苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定 一、? 目的 掌握纯化酶的基本操作和方法；学习一种常用的酶活力测定法。 二、 原理 苯丙氨酸解氨酶（ L-phenylalanine ： ammonia lyase, 简称 PAL ； EC4 . 3 . 1 . 5 ）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。 PAL 催化 L- 苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在 290nm 处有最大吸收值。若酶的加入量适当， A290 升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定 A290 升高的速率以测定 PAL 活力。规定 1h 内 A 290 增加 0 . Ol 为 PAL 的一个活力单位。 三、试剂和材料 (1) 0.l mol 硼酸一硼砂缓冲液 (pH8.7) (2) 酶提取液 0 .1 mol/ I 硼酸一硼砂缓冲液（含 1 mmol/ I, EDTA, 20mmol/ L β一巯基乙醇） （ 3 ） 0 . 6m.ol/ I- L 一苯丙氨酸溶液 （ 4 ） 6 mol/ l HCl (5 ）固体硫酸铵 (6 ） 0. 02mol/l- 磷酸盐缓冲液（ pH8.0, 含 0 . 5 mmol/ L EDTA, 2.5% 甘油， 20nlmol/ l . β - 巯基乙醇） （ 7 ） Sephadex G 一 25 （ 8 ） DEAE 纤维素 52 （ 9 ）标准蛋白质溶液（ 100ug/ ml ）：准确称取 mg 牛血清自蛋自于烧杯内，用蒸馏水溶解，完全转移到 100 ml 容量瓶内，定容至刻度，混匀。 （ 10 ）考马斯亮蓝 G-250 蛋白质染色液：称取 10 mg 考马斯亮蓝 G - 250, 溶于 5ml 95 `% 乙醇中，加入 85 ％（ W/V ）磷酸 loml ，混匀后即为母液。用时，按 15ml 母液加 85m1 蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。 （ 11 ）滴管 (l2) 止水夹 材料：供试植物材料 四、操作步骤 （ 1 ）酶液提取 植物材料 lg ，剪成小段，加入 5 倍体积的酶提取液，于冰浴上研钵研磨。 (2) 将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管， 10000g 冷冻离心 30 分钟。 (3) 取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，放置冰浴中备用。 （ 4 ）硫酸铵分级沉淀酶蛋白 从酶粗提液中吸出 0. 5m1 ，以作后面活力测定用。余下酶液根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到 38% 饱和度应加入酶液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。 将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌 10min ; 然后于 10 000 g 下冷冻离心 l0 min, 保留上清液于烧杯内。 根据硫酸安饱和度用量表，算出从 38 ％到 75 ％饱和度所需硫酸铵用量。按上述同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶于 1 ml 酶抽提液中。 （ 5 ） Sephadex G 一 25 层析脱盐 凝胶溶胀：称取 Sephadex G 一 25 5g, 加入适量 0 . 02mol/ I. 磷酸盐缓冲液，在室温下溶胀。待溶胀平衡后，虹吸去除上清液中的细小凝胶颗粒，这样处理 2 一 3 次。 装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，将 20m1 蒸馏水装入柱内，打开止水夹赶去出口内气泡，当柱内保留 1 ml 左右水层时，把处理好的 Sephadex G2 5 用玻璃棒搅匀，尽量一次加入柱内，待胶床表面仅有 1 - 2 cm 液层时，旋紧止水夹、。装好的胶柱应无气泡、无节痕、床面平正，床面铺 1 张圆形滤纸片。 上样：让胶床表面几乎不留液层，将 l ml 酶液小心注入胶床而中央，注意不要冲坏床面，吸取 lm ！磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在床表面仅有 lml 左右液层时，再小心地用滴管加入 5 - 6 cm 高的磷酸缓冲液洗脱。 洗脱收集：取刻度试管 5 支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸盐缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集 3m1 。 测定每管的 PAL 酶活力，合并 PAL 活力高的试管，记为酶洗脱液。 （ 6 ） DEAL 纤维素柱梯度洗脱 称取 DEAE 纤维素 52 干粉 1 一 1.5g ，加 20m1 的 0.02mol/ I. 磷酸盐缓冲液 (pH8 . 0) 浸泡 4h 以上（或浸泡过夜）。 装柱：把预处理的 DEAE 纤维素 52 装柱（方法及要求同凝胶层析柱）。装柱完成后，用 2 一 3 个床体积的 0 . 02 mol/ I_