2009-10分子生物学实验指导.doc

生命科学系 2009-2010学年度分子生物学实验 （0601班） 周玉亭 2009-2010学年度分子生物学实验指导 实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验二 质粒DNA的转化 实验三 质粒DNA的提取 实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 实验五 PCR基因扩增））） 质粒DNA的转化 实验目的：掌握质粒DNA的转化技术 实验原理: DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理 可以促进DNA的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Ampr）） 实验三 质粒DNA的提取 一、实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法 二、实验原理??碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。仪器、材料与试剂??(一)仪器??1．恒温培养箱??2．恒温摇床??3．小型高速离心机??4．??(二)材料试剂?带有pEM-T质粒的大肠杆菌??Solution I [50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol/L EDTA(PH8.0)] 2..??Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等体积汇合） 3.??Solution III (5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL) 4.??TE缓冲液 (P)[10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)] 5. 0.5mo1／L? RTE (含20μg/mLRNA酶A)??四、实验步骤?将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pEM-T质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜 2.将菌液加入1.5mL离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量； 3.在离心管中加入100μL溶液I,涡旋混匀，室温放置10min； 4.加入200μL溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）； 5.加入150μL溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。在冰上静置15min让质粒DNA复性； 6.12000r/min离心10min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中； 7.向上清中加入等体积（约450μL）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（去蛋白质和脂肪），手摇混匀，12000r/min离心5min，将上清移到另一个新的1.5mL离心管中（操作要平稳，不要将下边的有机相带上来）； 8.向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）（去微量酚和脂肪），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中（不要将下边的有机相带上来）； 9.向上清中加入2倍体积的无水乙醇（冰冷的），混匀后，室温放置10min。12000r/min离心10min，弃上清； 10.加入1mL冰冷的70%乙醇，吸打悬浮，12000r/min离心2min，再重复一次。将离心管中的乙醇倒净，倒扣在滤纸上吸干，再置超净台上15min，让酒精挥发干净； 11.加20μLRTE(含有RnaseA20μg/mL的TE缓冲液)，使质粒溶解，-20℃保存。 实验四、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术与方法 二、实验原理 三、仪器、材料与试剂??(一)仪器????(二)材料试剂’片段）（是实验三的回收产物） 琼脂糖 ＥＢ（溴化乙锭） 试剂： 5×TBE 6×loading-buffer(加样缓冲液) 实验步骤实验原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控等许多方面。仪器、材料与试剂PCR反应成分：①.模板DNA②.引物’P1 (10u