基因工程技术课程讲义.doc

上课时间：星期五7、8节1-5,7-9，地点：A理004星期六3、4节1-4,7-8,10，地点：A5102 课程代码——————————————————————————————————————— 《基因工程》课程讲义 在研究生物进化的过程中，遗传和变异是两个重要的概念。 遗传赋予生物的稳定、保证生物物种的世代延续。 变异赋予生物的进化、保证生物物种对各种环境的适应。按照现代遗传学范畴，变异有三个不同的层面： 在生物进化过程中，自然发生的变异，这种变异频率发生很低，时间漫长，变异主要是针对环境变化的适应性。长期的自然选择创就了地球上的所有天然物种。 在现代动植物育种中，人工选择所造成的变异，这种变异时间相对较短，具有可塑性，在物种内发生，朝着人为选择的方向进行，利用这种变异培育出了新的品种，提高了物种的生产性能和品质特性。 在分子遗传学和分子生物学研究中，重组DNA所造成的变异，在物种之间按照人们事先设计好的蓝图进行，时间短暂，能创造出世界上本来就没有的新物种。这种变异就是我们今天要讲的基因工程范畴。 基因概念的发展 1865年，孟德尔在豌豆试验中提出了抽象的“遗传因子”概念； 1909年，约翰森第一次提出了“基因”概念代替“遗传因子”； 上世纪30年代，摩尔根证明了基因是以线性形式排列在染色体上，是遗传的最小单位； 上世纪50年代，随着DNA双螺旋结构的发现，认为基因就是DNA片段； 上世纪60年代，本泽提出了基因的内部结构，突变子、重组子和顺反子三个结构单位。 以上是基因概念从经典遗传学上升到分子遗传学的发展历程。 基因工程理论依据： 任何基因都具有相同的物质基础——DNA； 基因是可以切割的； 基因是可以转移的； 蛋白质多肽与遗传基因存在对应的关系,即三联密码子是通用的； 5）基因通过复制可以遗传给下一代。 基因工程的概念 基因工程（gene engineering）又称基因操作（gene manipulation）或重组DNA（recombinant DNA）是一门以分子遗传学和分子生物学理论为基础，以生物化学和微生物学的现代方法为手段，将来源不同的遗传物质（基因）即DNA分子，按照预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA，然后通过载体导入受体细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新物种（品种）或研究基因结构与功能的现代生物技术。 基因工程最大的优点是打破常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。 基因工程有两个基本特点是基因在分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 一、基因工程研究的发展史 基因工程的历史可以回溯到分子遗传学诞生的上个世纪40年代。但是，分子生物学和分子遗传学理论上的三大发现和技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用。 1、理论上的三大发现： 1）遗传物质DNA：1928年，格里菲思（Griffith）肺炎双球菌肺炎双球菌1944年，美国学者埃弗里等在肺炎双球菌中转化因子是脱氧核糖核酸(DNA)，从而明了遗传的物质基础Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，这一发现常被认为是分子遗传学的真正开端HindⅡ，1972年Boyer发现了EcoRⅠ，这些酶可以特异性地切割DNA分子。 连接酶：1967年，世界上5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，如T4DNA连接酶，它们可以参与DNA裂口的修复和DNA分子的连接。 2）DNA分子序列分析及相关技术：例如DNA分子的核苷酸序列分析技术、琼脂糖凝胶电泳和SOUTHERN杂交技术等，对基因工程的开展起到了促进作用。 3）克隆载体：1973年，Cohen发明了质粒载体，如Psc101。有了DNA体外重组的切割与连接工具，但是DNA片段不具备自我复制的能力，因此，重组的DNA分子必须与一种特定的、具有自我复制能力的DNA分子连接，才能在寄主细胞中繁殖表达，这种DNA分子就是载体。 1972年美国斯坦福大学的科学家Berg教授发表的题为“将新的遗传信息插入（猿猴）SV40病毒DNA的生物化学方法：含有λ噬菌体基因和E.coli半乳糖操纵子的环状SV40 DNA”的论文，构建了历史上第一个体外重组的DNA分子（但是没有得到表达，只完成了基因工程的一半工作）。 1973年斯坦福大学的Cohen在体外重组DNA分子，并使重组DNA分子的功能在细胞中得到表达： 将大肠杆菌的抗四环素（Tcr）的质粒PSC101和抗新霉素（Ner）与抗磺胺类药物（Sr）的质粒R6-3，在体外用限制性核酸内切酶EcoRⅠ切割，用T4DNA连接酶连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中，在含有四环素和新霉素的平板中，筛选出抗四环素和抗新霉素的重组菌落（TcrNer）。这个研究成果标志着基因工程技