基因工程要点总结.docVIP

一、名词解释 1、基因工程，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 2、载体：是指携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具 。即指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。 3、LacZ’基因：编码b-半乳糖酶的a-肽链，即氨基末端。 4、多克隆位点区域片段：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点噬菌体吸附到寄主细胞表面之后，注入DNA，噬菌体的DNA进行复制及蛋白质的合成，并组装成噬菌体颗粒，最后使寄主细胞裂解，释放出子代噬菌体颗粒的过程植物生物反应器是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。通过基因转移技术获得的整合有外源基因的动物个体。双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称为回文结构lacZ’基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。 （2）当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑。 2、用于核酸操作的工具酶及其作用。 （1）限制性核酸内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。 （2）DNA聚合酶：以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3’-OH端而合成新的DNA。 （3）DNA连接酶：负责双链DNA中相邻3’-OH与5’-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。可促使具有互补粘性末端或平头末端的载体和供体DNA片段结核或连接，以形成重组DNA分子。 （4）碱性磷酸酯酶：a 从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5’磷酸根残基 b 用于5’端标记32P c 用于防止载体的粘性末端的自连 末端转移酶：用于人工接头，探针标记 印迹技术及应用 Southern blotting：检测NC膜上的DNA片断 Northern blotting：用于基因表达的特异性分析和定量分析。 Western blotting：（1）检测样品中特异蛋白存在与否 （2）细胞中特异蛋白的半定量分析 （3）蛋白质分子相互作用的研究 4、大肠杆菌表达外源基因的优势 （1）繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 （2）基因克隆及表达系统成熟完善 （3）全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 （4）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 如何用大肠杆菌生产人胰岛素 基因工程法制人胰岛素 甲醇酵母表达系统 利用甲醇作为唯一碳源。乙醇氧化酶将甲醇氧化为甲醛，乙醇氧化酶的启动子是强启动子，编码乙醇氧化酶的基因是AOX1和AOX2，主要是AOX1. AOX1基因的表达受甲醇严格调控，诱导表达水平可达30％以上。 诱导机制：培养基以葡萄糖或甘油为碳源，抑制转录； 培养基以甲醇为唯一碳源时，诱导基因转录、蛋白表达 基因治疗的基本程序 ①目的基因的克隆 ②基因转移系统的建立 ③靶细胞的选择 ④基因的导入。 目的基因的选择与制备 受体细胞的培养 ( 载体的选择 ( 将目的基因导入靶细胞(导入方法的选择) ( 转导细胞的筛选和鉴定 ( 基因治疗的安全性监测和疗效评价 具有靶向结合的载体 靶细胞的选择 体细胞(somatic cell)基因治疗 只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 生殖细胞(germline)基因治疗 1、对缺陷的生殖细胞进行矫正 2、当代及子代 常用的靶细胞 a造血细胞 b皮肤成纤维细胞 c肝细胞 d血管内皮细胞 e淋巴细胞 f肌肉细胞 g肿瘤细胞 9、蛋白质四大工程具体内容 蛋白质工程4大类研究： （1）、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。 （2）、定量确定蛋白质结构-功能关系。包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋白质变异的探讨等。 （3）、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构-功能关系的蛋白质。 （4）、根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。