实验1大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲.docVIP

实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲 实验目的 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求。实验材料 配制LB液体培养基，，加水50mL溶解 配制LB固体培养基，，加水50mL溶解配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面。实验步骤 培养基灭菌。在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和0mL LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔滤膜。既可以通气，又不使细菌进入。)。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅中，灭菌15min。 同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。 倒平板，倒斜面。 灭菌后。将有培养基的三角瓶试管培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。 超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风白炽灯。 将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约20mL倒入1 个培养皿中。倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。 倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。试管斜靠在平放的铅笔上，冷却凝固。 液体培养基用于大肠杆菌的扩大培养。 将大肠杆菌和有液体培养基的三角瓶放在左手中，靠近酒精灯火焰；右手拿着接种环，并用右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使环接触培养基冷却后，再取菌种。将菌体放入三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。三角瓶在37℃摇床上震荡培养12h（转速200转/分）。这一步骤由老师完成。 划线分离，分离菌种。 在酒精灯火焰上灼烧接种环，将摇床上培养12h的菌液（老师代做）打开，接种环部分深入到菌液中（只一次）。然后，在固体培养基的平板上连续划，接种环只在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养基。将培养皿倒置（盖在下面），放在37℃恒温培养箱中培养12~24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已经被分离。 划线的目的是分离菌种。用接种环以无菌操作取细菌悬液一环，在平板培养基的一边，做第一次平行划线2～3条。转动培养皿约70度角，用烧过冷却的接种环，通过第一次划线部分，做第二次平行划线。用同法通过第二次平行划线，做第三次平行划线。注：每下一次的划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，待接种环冷却后，接种环需通过上一次的划线获得菌种后再进行下一次的划线分离（如图B、C，我们这么做就是为了使第一次划线后的菌种浓度降低，以达到得到单菌落（分离菌种）的目的）。 菌种保存在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种到斜面上，37℃培养24h后，4℃冰箱保存。4℃是一个保菌温度。 1-1