实验4转基因植物PCR基因扩增及电泳检测.docVIP

实验PCR检测 四、转基因植物PCR基因扩增及电泳检测 一、实验目的 1.学习转基因植物PCR基因扩增的基本原理。 2.掌握转基因植物PCR基因扩增的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。 二、原理 PCR检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分进行判定。由于目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV35S启动子和NOS终止子这两种基因表达调控序列或其中之一，而CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列早已公开。故在对食品样品的转基因背景一无所知的情况下，根据CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列设计合适引物，通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV35S启动子和NOS终止子基因序列，来判定该食品是否为转基因食品。 三、试验材料 提取的甘薯基因组DNA。 四、试剂 4.1 PCR反应引物序列 35S：5，-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3，//5，-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3，； NOS：5，-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TC-3，//5，-TTA TCC TAG TTT GCG CGC-3，。 4.2 PCR反应试剂： 无菌去离子水；模板DNA；20 μmol / LPCR 引物；5U/μL Taq DNA 聚合酶；2.5 mmol / L dNTPs；10×PCR 缓冲液；25 mmol / L MgCl2，25 mmol / L KCl , 20 μg / mL 灭菌无核酸酶的牛血清白蛋白 4.2 核酸电泳相关试剂（见实验6） 五、仪器 5.1 PCR扩增仪。 5.2 微量移液器。 5.3 吸头。 5.4 电泳仪。 5.5 电泳槽。 5.6 凝胶成像仪。 5.7 PCR管 六、实验步骤 6.1 转基因植物PCR基因扩增 6.1.1 每管PCR反应溶液如下： 试 剂 剂 量 试 剂 剂 量 无菌去离子水 13.125μL 2.5 mmol / L dNTPs 2.0μL 10×PCR 缓冲液 2.5μL 5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.125μL 25 mmol / L MgCl2 2.5μL 20 μmol / LPCR 引物 0.625μL 20 μg / mLBSA 2.5μL 模板DNA 1.0μL 总体积 25μL 具体操作： 6.1.1.1 按待检样品数（每一个样品分设35S和NOS两个检测反应）并加空白对照、阴性对照、阳性对照，取一定数量的无菌无污染的洁净干燥PCR管，按下表用记号笔在管壁上编号： 样品 空白对照 阳性对照1 阳性对照2 阴性对照1 阴性对照2 待检样品1 待检样品1 引物 35S 35S NOS 35S NOS 35S NOS 模板 无菌水 质粒pBI121 质粒pBI121 非转基因样品 非转基因样品 转基因样品1 转基因样品1 6.1.1.2 之后按上述顺序依次加入各PCR反应液。因各反应管仅引物和模板不同，为了取液方便，也可按实验反应所需其他成分的总量先加在一1.5mL离心管中混匀，后用移液器分装至各管，再分别添加引物和模板。 6.1.1.3 各反应液添加完毕后，将反应管放入微型离心机稍离心（如 5 000r/min离心5－10s）混匀。 6.1.1.4 放入PCR仪进行扩增反应。 6.1.2 PCR扩增条件参数： 94°C预变性3min，按以下条件进行40个循环：94°C变性20s，54°C退火40s，72°C延伸60s，40个循环结束后，在72°C延伸3min。PCR反应结束后，将反应管取出，直接进行电泳分析，也可置4°C冰箱保存过夜。 6.2 PCR产物的凝胶电泳分析 采用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。电泳缓冲液采用1×TAE或0.5×TBE。 加样顺序： ①100bp DNA Ladder分子质量标记；②0号空白对照管：③阳性对照P—1；④阳性对照P－2；⑤阴性对照NT；⑥待检样品1－1；⑦待检样品l一2 6.3 电泳结束后，用凝胶成像系统对结果进行分析或用核酸紫外观测仪进行观测拍照。 6.4 结果分析 PCR产物的电泳预期结果如下表： 管号 0 P-1 P-2 NT-1 NT-2 1-1 1-2 样品 空白对照 阳性对照1 阳性对照2 阴性对照1 阴性对照2 待检样品1 待检样品2 电泳条带分子质量 无 195bp 180bp 无 无 195bp 180bp 七、说明及注意事项 避