实验七植物蛋白的提取.docVIP

实验七、植物蛋白的提取一、实验目的熟悉植物蛋白提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。二、实验原理植物蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；减少对蛋白质的人为修饰；破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则，植物蛋白制备过程中一般需要有四种试剂离液剂：尿素和硫脲等；表面活性剂：SDS、胆酸钠CHAPS等；还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base 等；蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在其中加入0.15mmol/L EDTA，同时使金属蛋白酶失活。三、仪器和试剂仪器离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱试剂1. 20mL 样品提取缓冲液：2.5mL 0.5mol/LTris-HCl3. -20下预冷丙酮4. （1）标准蛋白质溶液：用0.9%NaCl标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）配制成10mg/ml的标准蛋白溶液。 （2）双缩脲试剂：称1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中或内壁涂以石蜡的瓶中。此试剂可长期保存若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。四、 实验步骤改良丙酮沉淀法提取叶蛋白1、蛋白提取 取0.3g 左右的植物叶片，加入4mL 提取缓冲液色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP，转入 mL离心管中，摇匀并放在4条件下提取h，充分溶解蛋白。4000r/min 离心0min，弃沉淀，上清液中加入2.5～3倍体积的-20℃条件下，让蛋白充分沉淀。之后，4000r/min 离心min，上清，使丙酮完全挥发加入上样缓冲液溶解沉淀，沉淀充分溶解后，转移至1.5mL 离心管中，410000r/min 离心5min ，取上清液即为所提取的蛋白溶液。取支试管分两组，分别加入0，0.，0.，0.，0.， 0毫升的标准蛋白质溶液，用0.9%NaCl补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。mg/ml） 1 3 5 7 9 0 吸光度（A） （2）样品测定 取提取的蛋白质溶液0.1ml，加0.9%NaCl溶液0.9ml，双缩脲试剂4.0ml，混匀，于37℃水浴中放置20min，在540nm波长下进行比色。以标准曲线第6管（空白）调零点，测其吸光度（A）。根据吸光度值查标准曲线，即可求出样品中蛋白质的浓度。（注意样品浓度不要超过10mg/ml 样品蛋白质（%）= 样品体积（ml） × 100 从标准曲线上查得蛋白质含量（mg）