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实验二 光合细菌的分离与纯化 (红螺菌科细菌的富集培养、分离及纯化) 一、目的要求 学习并掌握从高浓度有机废水或污泥中采样、富集培养、分离、纯化红螺菌科细菌。了解培养兼性光能异养型细菌的培养基和培养方法。 二、实验材料 (一) 菌源 高浓度有机废水污染的污泥。 (二)培养基 红螺菌科细菌分离和增殖培养基 (三)仪器 厌氧光合培养装置。 (四)其他物品 玻璃圆桶标本缸、稀释分离用的无菌水、无菌培养皿、移液管、玻璃涂棒等。 三、实验内容 (一)采样 红螺菌科细菌广泛分布于高浓度有机废水中，可在柠檬酸发酵厂、味精厂、抗生素发酵厂、豆腐工场、洗羊毛工场等地任选择一处废水直接排放口，用无菌铲子直接取生长有光合细菌的底泥50—l00g，装入透明的玻璃圆捅标本缸内，再取上述有机废水l00m1，加入本缸内，带回实验室。采样时记录地点、日期、水温、pH、有否H2S等气味。 (二)富集培养 利用生理特性上的差异，选择性地使所需光合细菌生长，而抑制另一类光合细菌增殖。我们使自然水域厌气层中发生的生态学现象重现圆桶玻璃标本缸里。将200 m1红螺菌科细菌培养液倒入缸中，与底泥、污水搅拌均匀，然后在标本缸上层液面小心加入液体石蜡以隔绝空气，在25℃－35℃下用5000-10000 lx的光照强度进行光照培养2－8周(最好用白炽灯，40-60 w，圆桶玻璃标本缸应放在离电灯15－50 cm处，见图6－3－1)。数周后，圆桶玻璃标本缸内各种微生物均生长起来，由于发酵性细菌、硫酸盐还原细菌增殖，水层中积累了CO2和H 2S，满足了光合细菌的营养来源，造成厌气状态，于是光合细菌大量繁殖，由于厌氧、光照条件控制．标本缸玻璃壁上出现红色菌落状菌团。 图6-3-1 光合细菌的富集培养法 然后用无菌滴管自光合细菌生长良好的圆桶玻璃标本缸内壁处，吸取红色细菌和污水汁l—2滴，移植到另一圆桶玻璃标本缸中或试剂瓶中，加灭过菌的红螺菌富集培养液，培养液加至瓶中，试剂瓶加盖橡皮塞，用胶布封口，造成厌氧状态，继续光照、厌氧培养时保持28℃，圆桶玻璃标本缸或试剂瓶中菌的颜色逐渐改变，培养物的颜色因菌种不同而界，可变为红色、紫色或茶色。待菌生长良好后(1至数周)，再按上述同样步骤转接第二、三次培养基中培养。直至红螺茵科细菌(棕红色)占优势。 (三)分离纯化 先将已融化并冷却至45—50℃左右的红螺菌分离培养基(含1．2％琼脂)倾倒平板；再用已经过过滤除菌的0.05％抗坏血酸溶液对富集培养的红螺菌科细菌菌悬液适当稀释；以划线分离法或涂布分离法将稀释的红螺菌科细菌菌恳液在平板上进行分离，放置暗处2—3h(需2—3h后培养皿或瓶内才达厌氧状态)，然后再依次放入厌氧光合装置中。28℃厌氧光照培养1周，待棕红色菌落出现后，经镜检为纯培养物，可穿刺接种上述琼脂平板或半固体深层培养基(注意接种时不要将接种针穿透琼脂底部)，上层添加灭过菌的液体石蜡，28℃、3000 lx光照条件下厌气培养48h，也可穿刺或接种到带有螺旋盖帽、内装红螺菌分离培养基斜面的厌氧管中，稍稍松开螺旋盖，放入厌氧光合装置中，待长出菌落后，立即旋紧螺盖，保存于20℃暗室内，2周传代一次。 注：厌氧光合装置可采用透明真空玻璃干燥器，抽真空后补充氮气或补充95％H2和5％CO2的混合气体，以保证厌氧环境，再配以白炽灯光照条件即可。 (四)红螺菌科与着色菌科的鉴别 红螺菌科和着色菌科在分类位置上同属于细菌门真细菌纲红螺细菌目，它们都是单细胞，二等分裂，少数芽殖；多数有鞭毛能运动，少数不运动；DNA碱基组成中G＋C mol值含量范围为46％-73％。因细胞内含类胡萝卜素使菌体呈紫红色或褐色。鉴别时要注意两科细菌的区别。着色菌科细菌在需氧黑暗处不生长，细胞内或外(其中一属)积累S颗粒、严格光能自养型；红螺菌科细菌在需氧黑暗处可生长，细胞内外无S颗粒积累。属于光能异养型。两科主要区别见表6-3-1。 表6-3-1 红螺菌科与着色菌科性质比较 项目 红螺菌科 着色菌科 光合作用主要类型 光能异养型 光能自养型 需氧黑暗生长 +或－ － 氧化H2S能力 +或－ + H2S氧化成SO42- － + 过程中S的积累 － + 对H2S的毒性 通常高 通常低 表6-3-2 红螺菌科三个属的区别 属名 细胞形状 鞭毛 细胞分裂方式 菌柄 红螺菌属 螺旋状 极生 二等分裂 - 红假单孢菌属 柱状或卵球形 极生 二等分裂或芽殖 - 红微菌属 卵球状 周生 芽殖 +