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食品质量与安全专业 食品微生物检验 课程实习方案 邵阳学院生物与化学工程系 2012-12 实习一： 腐竹中细菌数目的检测 一、实习地点、时间、单位 实习时间：2012.12.19 星期三 实习地点：3栋104 3栋108 实习单位：邵阳学院 二、试剂及器材准备 器材包扎1ml吸管 4根,500ml烧杯4个,250ml三角瓶 3个,研钵一个, 滴定管一根,试管4根,玻璃棒2根,培养皿 12个,涂抹棒一根,洗耳球一个, 牛角匙一个,瓷杯一个,漏斗、橡皮管、铁架台、电磁炉、天平均一个, 铁架台一套，pH试纸，标签纸2个，纱布，棉花，棉线若干， 高压蒸汽灭菌锅一台，恒温培养仪一台，超净工作台。 三、实习实验步骤： 1、培养基的制备： 牛肉膏蛋白胨培养基（LB） 配制500ml培养基 配方： 药 品 牛肉膏 蛋白胨 琼脂 去离子水 Na Cl PH 剂 量 1.5g 5g 11g 500ml 2.5g 7.4-7.6 配制步骤： 称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、Na Cl放入烧杯中。】 牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 溶化：在瓷杯中可先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在电磁炉上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，可先称好琼脂，然后用剪刀剪碎。在培养基灭菌前加入进去搅匀即可（灭菌时的温度可让琼脂溶化充分）。 调pH：在未调pH前，先用pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH ，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl 进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。 分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免玷污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 （5）加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。 （6）包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外报纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 灭菌：将上述培养基及试验相关仪器、容器放入高压霉菌锅中灭菌（灭菌时小组需有人留下看守）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 （8）倒平板：及时将15 mL～20 mL 冷却一会儿的牛肉膏蛋白胨培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 2、 样品的预处理及稀释 经过处理的样品溶液可保存于冰箱中，以便下次试验再用） （1）腐竹为固体样品，预处理： 以无菌操作取25g 样品，置盛有225 mL 无菌水的无菌研钵内，再转移至500ml烧杯中，充分振摇，即制成1:10 的样品匀液。 （2）十倍稀释： 用1mL 无菌吸管吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL无菌水的无菌试管中（注意吸管不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。 3、 倒平皿前准备 开启无菌工作台，先紫外线灭菌在进行通风。 4、 倒平皿（培养皿中培养基不宜过多） 培养皿的的冷却。 5、 接种： 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液，（根据对腐竹的污染情况估计可选取10^-2、10^-3、10^-4三个稀释度）在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做3个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。（注：每个稀释度做三个平皿的好处在于有利于排除错误的平皿，单数量的平皿也有利于选取中间菌落数，防止一大一小不好取舍，使得数据更加准确） 6、 将接种的培养皿放置10—20min 目的是使样品液侵入培养基。 7、 倒置培养 培养条件： 温度：36±1℃ 时间：24±1h 观察计数 选取菌落数在