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拼接和修复操作流程 一 ：拼接 1、引物登记： 新引物到时，认真核对引物条数，按照基因名详细记录在引物登记本上。 2、溶引物： 将引物按顺序隔排排放到96孔平板上，（注意将GR基因两条重复的首尾引物各取出一条）向每管引物中加入300ul1*TE，并在每管管盖上标记出基因名称和引物序列号，注意不要错标。测序引物单独拿出来，交由测序人员保存，用时再溶解。 3、振引物： 将每板引物用涡旋震荡器震荡均匀，每板引物震荡时间不少于2分钟。 4、写拼接方案： 根据每条基因的引物条数对其进行分段，每段引物在12-18条之间，标示出各段的基因长度，并依据基因的平均Tm值以及GC%选择一个合适的 退火温度。一般退火温度稍高于平均Tm值，并根据GC%进行调整。若GC%大于60%时，要适量加入DMSO，最后写好基因的重叠延伸方案。 5、混引物： 按照拼接方案的分段方法，对各段引物进行混合，每条引物取5ul混合于1.5ml离心管中，充分震荡，混合均匀。 6、准备反应： 找到各段的首尾引物，按顺序与混合引物排列好，准备好一管灭菌水和总管。总管配置方法如下： 5*pfu Buffer 10ul * 40 400ul pfu DNA 聚合酶 0.6ul 24ul dNTP 1ul 40ul H2O 13.4ul 540ul 注意配置总管是要确保每个成分的质量，每次新领取的成分用之前要检测。 7、预扩增反应： 反应体系如下： 反应程序下： 混合引物 3ul 1、 94℃ 2min 2、 94℃ 20s 3、 退火温度+4℃ 20s 总管 25ul 4、 72℃ 14s H2O 22ul 5、 94℃ 20s 6、 退火温度 20s 7、72℃ 14s - 8、 94℃ 20s 9、 55/60/65 20s 10、 72℃ 14s 11、 72℃ 2min 注意：配好反应体系后要离心，确保PCR管中没有气泡。如有气泡会影响Pfu 酶的活性。 其中2-4号程序是个降落PCR（Touch down PCR）每个循环退火温度下降1度，运行4循环，5-7号程序,运行8个循环，8-10号程序，运行8个循环。 其中延伸温度根据片段大小决定，pfu的聚合速度为1kb/30s 8、二次扩增反应： 反应体系如下： 反应程序如下： 预扩产物 1ul 1、 94℃ 2m