木聚糖活力测定步骤.docVIP

木聚糖酶活力测定方法 原理 ???木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。 菌种发酵复筛 在无菌条件下，菌株接种到基础产酶培养基的三角瓶中，放置28℃，转速160r/min恒温培养摇床上振荡培养5d。 粗酶液制备 将发酵液过滤，在3000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。 试剂配制 木聚糖底物缓冲液配制 甲液：称取无水醋酸钠（NaAc）8.203g，用蒸馏水溶解，定容至500mL。 乙液：用量筒量取99.5%HAc5.78mL，含HAc6.035g，定容至500mL。 pH4.8醋酸缓冲液：甲液与乙液的比例：3:2 标准木聚糖溶液：木糖80℃烘干至恒重。标准称取1.000g木聚糖，加PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液溶解，定容至100ml。 1%木聚糖溶液：称取木聚糖1.00g加入PH5.5醋酸缓冲液，加热溶解后，定容至100ml。 DNS配制 称取酒石酸钾钠182.09g，溶于500mL蒸馏水中，加热（不超过50℃）于热溶液中一次加入3,5-二硝基水杨酸6.39g，NaoH21.09g，苯酚5.09g，无水亚硫酸钠5.09g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮存棕色瓶中，室温保存，放置一个星期后使用。 标准木糖曲线的制作 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。 分别吸取木糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。 分别取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液和5.0mLDNS试剂。电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。 ???以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线. 酶样测定 吸取10.0mL木聚糖溶液,37℃平衡20min。 吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。然后加入100mg/ml木聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s-5s。以标准空白样(2.1.1)为空白对照，在540min处测定吸光度AB。 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入100mg/ml木聚糖溶液2.0mL(已经过37℃平衡),电磁振荡3s-5s。37℃保温30min。加入5mLDNS试剂,电磁振荡3s-5s，以终止酶反应。沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温，加水定容至25mL,电磁振荡3s-5s。以标准空白样(2.1.1)为空白对照，在540min处测定吸光度A。 计算? 酶活定义： 1g酶粉或1ml酶液在37℃、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位U。 用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力按式（1）和式（2）计算： ???????? XD=【(AE-?AE)*K+C0】/(M*t)*1000???????………………………?（1） 　　式中： 　　XD-稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml； ??? AE-酶反应液的吸光度； ??? AB-酶空白样的吸光度； ??? K-标准曲线的斜率； ??? C0-标准曲线的截距； ??? M-木糖的摩尔质量，M(C5H10O5)=150.2g/mol ??? t-酶解反应时间，min ??? 1000-转化因子，1mmol=1000umol. ??? XD值应在0.04U/mL-0.08U/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。 ?????????X=XD*DF?????????????………………………………?? （2） ?? 式中： ?? X-试样中木聚糖酶的活力