渗透调节物测定实验计划.docVIP

渗透调节物测定实验计划 本实验做两次，每次4个重复 预计在07年10月完成，具体安排如下： （一）第一次实验： 1、07年9月12日：培养基中培养12天 2、07年9月24日：移苗（需2天） 3、培养箱中培养13天，即到10月7-8日左右开始驯化测定 （二）第二次实验： 在第一次实验后第4-5天开始进行 培养条件：白天/黑夜 23℃/19℃，12小时光照/12小时黑暗，湿度85%/70%，光照强度60/0 计划种植： 1、5个缺失基因型+野生型，一个基因型一次重复种2盆，4次重复种2*4=8盆。 2、要测的渗透调节物包括脯安酸、可溶性糖和甜菜碱。所以一个基因型一次渗透调节物的测定总共需要2*4*3=24盆。 3、6个基因型总共种6*24=144盆。（一个培养箱刚好放完） 三、培养基培养： 1、MS培养基配1000ml。各母液取10ml，琼脂称6g，蔗糖称30g。一个基因型种24*9=216株 2、一个基因型在4个培养皿中培养。总共4*6=24个培养皿 分析参与低温驯化的PLD对渗透调节物质的影响。对该PLD基因缺失植株和其野生型进行低温驯化之后，测定脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱3种渗透调节物质的水平。 脯氨酸和可溶性糖的测定方法Liweiqi： 脯氨酸的测定： 在4℃低温条件下连续驯化3-4d，取冻干的样品0.05-0.5g（我们取0.1-0.2 g，待定）。冻干样品的方法：许师姐的仪器。 在室温条件下，用75%的乙醇4 ml萃取样品粉末24h（过夜）。 20,000g离心5 min。 小心向上清液中加75%的乙醇到5 ml。 测定： 1、0.1ml 提取液+0.9ml 水合茚三酮试剂(1%(wt/vol)水合茚三酮,60%(vol/vol)冰乙酸,40%蒸馏水)。 2、在100℃水浴锅中反应1h。 3、加3 ml甲苯，涡旋。 4、在23℃条件下萃取24 h。 5、用75%的乙醇做空白对照，在520 nm处测定吸光值。 标准曲线制作：1～10μg/ml范围的脯氨酸溶于75％乙醇中，配制出标准溶液。 1、0.1ml 提取液+0.9ml 水合茚三酮试剂(1%(wt/vol)水合茚三酮,60%(vol/vol)冰乙酸,40%蒸馏水)。 2、在100℃水浴锅中反应1h。 3、加3 ml甲苯，涡旋。 4、在23℃条件下萃取24 h。 5、用75%的乙醇做空白对照，在520 nm处测定吸光值。 依脯氨酸的量和相应的吸收值绘制标准曲线 计算：提取液的脯氨酸含量(μg/ml)*植物样品稀释后的体积(ml)/植物组织的鲜重(g)*100% 用相同的提取液测定可溶性糖（Soluble sugar）: 1、用1000μl蒽酮测糖试剂(0.15%(wt/vol) 蒽酮，72%(vol/vol)硫酸，28%蒸馏水)萃取20μl提取液。 2、在100℃水浴锅中反应1h。 3、在625nm处测定吸光值，蔗糖值用葡萄糖当量表示。 仪器： 霜箱、电子天平、冻干仪器、20,000g离心机、水浴锅、UV-2500、10ml试管21个 试剂： 脯氨酸 75%的乙醇 水合茚三酮试剂：1%(wt/ vol)水合茚三酮，60%(vol/vol)冰乙酸，40%蒸馏水 甲苯 可溶性糖 蒽酮测糖试剂0.15%(wt/vol) 蒽酮，72%(vol/vol)硫酸，28%蒸馏水 在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。