漆酶高产菌株筛选实验方案.docVIP

漆酶简介 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。 漆酶为含铜的糖蛋白，约由 500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。糖配基占整个分子的 10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。 漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。 分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。 实验一 高产漆酶菌株酶活测定 1 主要试剂的配制 （1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液 A液：0.2 mmol/L21.014 g，加入蒸馏水溶解定容至500mL。 B液0.2 mmol/L柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g，加入蒸馏水溶解定容至500mL。 A液和B液混合，搅匀，于pH计上调节至pH4.5。 0.5 mmol/L的ABTS溶液 将一片ABTS片剂（142 mg/片）用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至250 mL，配成1.0308 mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液定容至100 mL。 2 实验方法 漆酶活性的测定方法： ① 从三角瓶中取出适量酶液，离心取上清得到粗酶液，放于样品管中U/mL = 式中： ----ABTS在420nm下吸光系数，为； ----1min； ----1min内，吸光度OD的变化值； V1----酶反应中，反应液的总体积，3mL； V2 ----酶反应中，酶液的体积，2mL。 实验二 高产漆酶菌株的酶学特性 1 主要试剂的配制 （1） 0.2 mmol/L pH2.0—8.0的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液 A液和B液混合，搅匀，于pH计上调节至pH。 0.5 mmol/L的ABTS溶液 将一片ABTS片剂（142 mg/片）用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至250 mL，配成1.0308 mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的ABTS母液，用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液分别配制100 mL的0.1 mmol/L、0.2 m、0.3 m、0.4 m、0.5 mpH3.5的条件下，配制0.1 mmol/L、0.2 m、0.3 m、0.4 m、0.5 mpH 2.0－pH 8.0pH 2.0－pH 8.0h后，在30 ℃，最适反应pH条件下，测定漆酶活性，以开始时漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的pH稳定性。 2.3 漆酶的最适反应温度和热稳定性测定 在漆酶最适反应pH条件下，分别在不同温度（20 ℃－80 ℃pH 3.5环境中，分别在不同温度（20 ℃－80 ℃1 h，在最适反应温度、最适反应pH条件下测定漆酶活性，以保温前漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的热稳定性。 2.4 表面活性剂对漆酶活性的影响 将漆酶置于含有1 mmol/L表面活性剂（Tris、 EDTA、 Tween80），pH 8.0缓冲液中，测定漆酶活性，以不添加表面活性剂漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，测定表面活性剂对漆酶活性的影响。 实验三 漆酶的固定化 实验原理 壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物降解、无毒易得的天然功能高分子材料，被广泛用来作为固定化酶的载体。壳聚糖分子中D－葡胺糖的-NH2可与双功能试剂戊二醛的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO与酶的游离氨基缩合