水果中诺如病毒检测方法的的优化.doc

水果中诺如病毒检测方法的优化Hee-Yeon Kima, In-Shin Kwakc, In-Gyun Hwangc, GwangPyo Koa,b 摘要：食品中诺如病毒(NoV)的检测对于食源性诺如病毒引起的爆发性疾病的研究和预防至关重要。然而，目前诺如病毒的检测方法还未有得到很好的检验或优化。本研究中，对不同水果中NoV的洗脱、PEG富集病毒以及使用RT-PCR提取病毒RNA的各种有效的方法皆进行了优化。首先，对6种不同的缓冲液进行水果表面NoV病毒的洗脱的方法评估。即将已知量的诺如病毒喷洒于葡萄、草莓、树莓表面，采用蒸馏水、0.05M甘氨酸-0.14M NaCl(pH 7.5)、2.9%胰蛋白磷酸肉汤-6%甘氨酸、100 mM Tris HCl(pH 9.5)、50mM甘氨酸-50mM MgCl2(pH 9.5)和3%的牛肉浸出物等6种缓冲液进行洗脱，RT-PCR检测结果表明：3%的牛肉浸出物对病毒的洗脱效果最佳。其次，对检测诺如病毒最常用的沉淀剂-PEG分别进行了不同分子量、作用时间和温度等三个因素的进行了评估，结果表明：PEG 10000，4h，室温条件为最佳。最后，对5种不同的RNA提取方法进行评估，表明：QIAamp Viral RNA Mini kit提取效果最佳。采用优化后的方法对不同水果总诺如病毒的检测显示，将近6-80%的NoV病毒粒子可以检出。引言 食物传播性病毒感染是人类疾病的重要因素(Mullendore et al., 2001; Myrmel et al., 2000)，NoVs在遗传和抗原上属杯状病毒属(Rutjes et al., 2006)，为人类非细菌性肠胃炎的重要的病原体(Mead et al., 1999; Vinje et al., 1997, 2003)。诺如病毒易感染的场所主要有老人院(Calderon-Margalit et al., 2005)、医院、游船、学校、餐馆和一些宴席上(Parashar et al., 1998; Rutjes et al.,2006)。 农作物成长阶段的水体污染以及食品加工和包装过程皆可以引起食品感染诺如病毒。诺如病毒感染的典型食物为带生的、未煮熟的肉或海鲜（如贝类）、方便食品以及水果和蔬菜等具有日常消费的食物(Bosch et al., 2001; Daniels et al., 2000; Guevremont et al., 2006; Hutin et al.,1999; Le Guyader et al., 1994; Potasman et al., 2002; Rosenblum et al., 1990; Rutjes et al., 2006)。因为这些食物都缺少热处理，因此都具有很高的感染风险。然而，由于缺乏合理的检测方法以及食物样品取样不便等因素使得诺如病毒引起的食物感染很少能被检测到(Cliver, 1995)。 进一步的研究表明，葡萄、草莓和树莓等许多水果为许多NoV感染的基质(Butot et al., 2007; Hill, 2003; Le Guyader et al.,2004)。因此，开发和优化NoV的检测方法对于预防和调查NoV的爆发具有重要意义。但是目前检测诺如病毒方法很少，并且限制于某些食物种类，如大部分诺如病毒的检测是针对贝类产品的(Baert et al., 2007; Dubois et al., 2002; Heller et al., 1986; Jaykus et al., 1996; Kingsley and Richards, 2001; Schultz et al., 2007; Shieh et al., 1999; Sunen and Sobsey, 1999)。本研究评估和优化了水果中诺如病毒检测的所有步骤，包括水果中病毒的洗脱、采用PEG进行病毒的富集以及RNA的提取。本研究旨在于（1）发现NoV洗脱的最佳缓冲液，（2）PEG沉淀病毒的最佳条件，（3）通过RNA提取对病毒进行洗脱液和沉淀剂进行比较。 方法与材料 2.1粪便样本和T-PCR测定 NoV GⅡ-4为引起许多食源性疾病爆发的基因型，检测样本为韩国疾控中心获得的感染诺如病毒的粪便，将其进行一系列的稀释后，采用RT-PCR进行定量检测。移取以10%悬浮于PBS中的粪便稀释物140μL，采用QIAmp Viral RNA Mini Kit试剂盒进行病毒RNA的提取。 T-PCR采用靶点病毒基因的衣壳编码区设计两组引物(Isakbaeva et al., 2005)，分别为：G2-SKF和G2-SKR，扩增产物为344bp(Kojima et al., 2002)。病毒RNA的反转录条件为42℃，60min，然后95℃，1