细胞培养方法与步骤.ppt

新生小鼠心肌细胞分离培养的改良及其鉴定 目录 一、实验目的 二、细胞来源 三、实验方法 1.细胞培养 2.实验操作 3.检测方法 四、预期实验结果 实验目的 通过改进新生小鼠心肌分离及其原代培养方法提高心肌细胞的活性和纯度构建新生小鼠心肌细胞分离及原代培养实验平台 体外培养的原代心肌细胞具有自发节律性和收缩性特征，能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神经体液等因素的干扰，可以从细胞分子水平阐明一些心脏发育及疾病发生的基本理论，在心肌细胞生长发育生理代谢病理等研究中具有重要作用. 细胞来源 出生0~3 d的清洁级SD新生小鼠，雌雄不限。 实验方法 一.主要材料与试剂 1.出生0~3 d的清洁级SD新生小鼠 2.胰酶（美国Sigma公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司）；5溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu)（美国Sigma公司）；肌球蛋白重链蛋白（MF20）单克隆抗体（武汉博士德公司）； 羊抗鼠Cy3标记二抗 （Santa公司）；Hoechest（美国Sigma公司）；CO2 恒温箱 （美国Thermo公司）；倒置显微镜XDS1B（广州粤显光学仪器有限公司）；NikonE440荧光显微镜（日本尼康）. 实验方法—细胞培养 二.细胞培养 1.心肌细胞分离 取0~3 d的SD小鼠10只，酒精擦洗消毒，用剪刀从最下端肋骨处开始剪开胸腔，找到心脏后，剪取心尖心室部分3，立即放入预冷的ADS缓冲液（116 mmol / L NaCl，20 mmol / L HEPES，0.012% NaH2PO4 2H2O，0.1% Glucose，0.04%KCl，0.01% MgSO4 7H2O）中漂洗3次，然后将心室组织拿到超净工作台中，剪成0. 5 -1 mm3大小的组织块，再用4 预冷的ADS缓冲液漂洗2次以去除血细胞及漂浮的结缔组织，加入用ADS缓冲液配制的消化酶8 mL（0.05Ⅱ型胶原蛋白酶和0.06%胰蛋白酶），然后将消化酶和组织的混合液吸入到50 mL的离心管中，置于37 恒温水浴摇床中，37 恒温振荡10 min. 重新加入8 mL消化酶，恒温振荡8 min，小心吸取上清到一个加有400 L胎牛血清的15 mL离心管中，混匀，1 000 r / min离心5 min，去掉上清，可看到离心管底部有淡黄色的细胞沉淀，加入37 预热的培养基3 mL（72% DMEM，18%M199，10%胎牛血清），吸打混匀，然后放到CO2培养箱（5% CO2，37 ）中培养，培养过程中注意离心管盖子不能拧的太紧，几分钟后要拿出来颠倒混匀几次. 重复消化4~5次，直到组织全部消化完。 实验方法—细胞培养 2.心肌细胞纯化及原代培养 待组织消化完以后，将收集到的细胞全部吸到一个细胞培养皿中，然后差速贴壁，即将细胞放到培养箱中让其贴壁30 min，因为心肌成纤维细胞比心肌细胞贴壁快，所以可将心肌成纤维细胞与心肌细胞分离，然后将培养液吸到一个15 mL离心管中1 000 r / min离心6 min，同时加入5 mL新鲜培养基到培养皿中继续培养心肌成纤维细胞，将离心后得到的上清吸到另一15 mL离心管中，1 000 r / min再次离心5 min，将得到的所有细胞沉淀用培养基（含0.1 mmol BrdU）4吸打混匀20 50次，吸到培养皿中，放入CO2恒温箱中培养. 实验方法—实验操作 三.实验操作 1.培养48 h后，在倒置显微镜下观察心肌细胞，分析用不同的分离培养方法所得到的心肌细胞的质量，并拍照。 . 2. 将心肌细胞和心肌成纤维细胞接种到盖玻片上面，取培养48 h的心肌细胞以及在差速贴壁中获得的心肌成纤维细胞作为阴性对照，吸去培养基，用PBS洗两次，用4%多聚甲醛固定30min，用PBS洗一次，用封闭液（1%的胎牛血清，5%的小牛血清 ，10%的 山 羊 血 清 ，0.05%的Triton X100） 室温封闭1 h，用PBS洗一次，取100 L肌球蛋白重链蛋白（MF20）单克隆抗体（1 100） 滴到接种有心肌细胞的盖玻片上，同时在接种有心肌成纤维细胞的盖玻片上滴100 LPBS，室温孵育1.5 h，用PBS洗3次，1 500羊抗鼠Cy3标记二抗室温避光孵育1 h，用PBS洗3次，最后用1 1 000hoechest染核，室温避光孵育15 min，PBS洗一次，在荧光显微镜下观察细胞，并拍照。 实验方法—测定方法 取相同量的0.4%苔芬蓝液与细胞悬液混匀，静置310 min，然后取适量混合液滴于细胞计数板上，计数总细胞数及未染成蓝色的活细胞数.计数10次，取平均值. 细胞存活率（%）=活细胞数/细胞总数（活细胞数+死细胞数）