细胞培养与生长测定.ppt

细胞生长测定的应用 细胞增殖或细胞活性测定 药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定 冷冻保护剂 冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。 冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类 渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。 目前多以渗透性冷冻剂较为常用 DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4 ℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在4 ℃下进行，一般需要40～60分钟。 冷冻保存方法 按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100 ℃以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。 玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。 但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。  非玻璃化冻存方法 【材料】 1.仪器设备：普通冰箱、低温冰箱和-70 ～-80 ℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等； 2.冻存管：容量为1ml或1.5ml； 3.冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解； 4.待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。 【操作程序】 1. 待冻存细胞悬液的制备 (1) 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数； (2) 将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜； (3) 向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml； (4) 按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖； (5) 再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。 2. 分级冷冻 先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8 ℃ ），约40min； 接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10 ℃ ～-20 ℃ ），约30～60min； 将冻存管转入低温冰箱（-40 ℃ ），放置30min左右； 然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70 ℃ ～-80 ℃ ），过夜； 最后将冻存管投入液氮保存。 3. 记录 做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。  冻存结果  如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。 非玻璃化冻存的复苏方法 主要材料 （1） 仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机； （2） 培养用液：完全培养液。 复苏过程 （1） 调配37 ℃ ～40 ℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37 ℃ ～40 ℃ ； （2） 从液氮中取出冻存管，立即投入37 ℃ ～40 ℃温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解； （3） 将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀； （4） 将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜； （5） 向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。 【注意事项】 细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。 细胞培养的生长测定 细胞培养的生长测定是指对细胞活力和细胞增殖的测定 1.细胞计数法 2.台盼蓝染色法 3.MTT比色法 4.细胞生长曲线法 一、细胞计数法 细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞密度。 【材料】 1.消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液 2.细胞培养液 3.血细胞计数板和盖玻片 【操作程序】 处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1-2min。待细胞变圆并将脱壁时，加入一定量的培养液，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接制成细