molecularclone(quiteuseful!)剖析.ppt

?? 本实验注意事项： 1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-ME处理 2．研钵预冻，粉末转管前加CTAB前不要融化 3．24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的 4．所用试剂必需灭菌，手套 思考： （1）试分析DNA降解的可能原因 （2）提高DNA产量的措施 所用到的试剂及作用（一）： 氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿加速有机相与液相分层，去除植物色素，蛋白质和多糖等。异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。 95%EtOH 沉淀DNA。 10M NH4AC 诱导乙醇沉淀较大DNA。 70%EtOH 去除微量Na+、K+、M2+等阳离子及小分子量的有机分子，洗脱CTAB 所用到的试剂及作用（二）： TE（1mMEDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并长期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子，从而抑制DNase等的活性。 外环境条件： pH8.0防止脱氨作用； 65℃ CTAB中DNase变性，促进内溶物释放； 离心时15℃以防CTAB沉淀而降低DNA量。 DNA质量检测 一．DNA检测常规项目 DNA纯度：紫外分光光度计A260/A280=1.8－2.0，质量好 分子量大小：琼脂糖凝胶电泳，50Kb左右与λDNA仿（清晰主带），质量好 DNA浓度：1 0D＝50ug/ml DS-DNA（浓度）数量40ug/ml RNA or SS－DNA 限制性内切酶操作 准备 1．调整DNA浓度，大致相当浓度300-400ng/ul ，每样品取等体积的量，质量好的DNA。 2．仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉分析条件及酶切的贮存浓度10u-50u/ul厂家配套试剂。 3．限制性内切酶贮存 buffer一般含50%甘油，若甘油在反应体系中超过5%即影响特异性，因此酶的体积1/10V总。 酶切体系： DNA(3-5ug，3ug) 8ul 10*buffer reaction 1.5ul Enzyme (8u) 0.8ul（冰上） Add H2O to 15ul 酶切终止及检测： 1、加上样缓冲液终止酶切，也可65℃加热10min 使酶变性失活。 2、电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。 若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做 。 出现切烂：DNA降解，重新提DNA； 切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。 ? A1优总DNA A2劣总DNA B1 酶切烂 B2酶切优 B3切不动 点样孔 转化子的鉴定（?互补）: 许多常用载体（pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短片段，其中含有?-半乳糖苷酶（LacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码序列，该编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到?-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。这种载体适用于可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段都没有活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的?-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种现象叫?互补。由?互补而产生的LacZ＋细菌易于识别，因为它们在生色底物x-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷)存在下，形成蓝色菌落，而外源片段插入到质粒的多克隆位点以后几乎不可避免地导致产生无?互补能力的氨基端片段，因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一颜色反应大大简化了质粒重组体的鉴定。 IPTG（异丙基硫代-?-半乳糖苷）：是?-半乳糖苷酶活性的诱导物，也可作为具有Lac或Tac启动子的表达载体的表达诱导物来使用。 蓝色菌落：载体自连 白色菌落：含外源片段 克隆中用到的几种工具酶 : 限制酶 碱性磷酸酶 连接酶 限制性内切酶： About 400 different restriction enzymes. RE were discovered in 1970s by Hamilton Smith and Daniel Nathans. They shared the 1986 Nobel prize in physiology or Medicine with Werner Arber. II类限制性内切酶的特点 1、有特定的识别序列，通常为4－6个碱基的回文对称序列。 2、切