PSII反应中心蛋白D1蛋白的磷酸化被内源性昼夜节律控剖析.pptx

;主要内容;1.背景;光合放氧涉及超分子蛋白色素复合物—光系统II。光系统II反应中心包括了D1和D2蛋白异源二聚体，并结合了PSII电子传递链的大多数非蛋白成分 。光对于D1蛋白代谢很重要，调节其的合成，膜内转运，翻译后磷酸化以及酰化，及其降解率。D1蛋白的翻译后磷酸化发生在苏氨酸残基的N末端，通过一个光依赖的氧化还原调节激酶来催化。 ;蛋白质磷酸化被真核生物用来调节细胞活性。在植物中，蛋白质磷酸化是对环境信号比如伤害和光的关键响应。在植物中磷酸化蛋白的最大浓度在叶绿体膜发现。D1蛋白的磷酸化和去磷酸化是严格光依赖的。捕光叶绿素脱辅基蛋白的氧化还原敏感的可逆磷酸化被认为是通过均衡PSII和PSI的电子流动的最大量子产率机制 可是，D1或其他PSII蛋白的磷酸化的作用在很大程度上是未知的。有人认为磷酸化调控D1蛋白降解，维持它作为替代前的存储形式，或者调节反应中心的二聚体。 ;光强对D1代谢机制的影响在实验条件下研究，用恒定强度的光强来辐照植物或类囊体膜。通常用完全黑暗的预处理或暴露在不同与最终使用的光强下。恒定光强照射不仅影响D1降解速率，而且影响非磷酸化D1蛋白的磷酸化比率。为了深入了解磷酸化的D1生理功能，我们在一个自然昼夜周期描述这个过程，即用自然波动的阳光强度。找出对合成肽的抗体，能选择性地检测各种形式的D1，磷酸化和去磷酸化D1，并可以在特定条件下测定D1蛋白磷酸化的比率。 温室中的自然光/暗周期下的少根紫萍，表现出总D1蛋白磷酸化比例的昼夜振荡(D1-P index: [D1-P]/[D1] +[D1-P])，与体内从头的D1磷酸化一致。当植物从光/暗循环移位到连续光照条件下，D1-P指数节律维持几个周期。这些结果表明D1蛋白磷酸化的昼夜节律调节，是叶绿体膜的一个关键PSII反应中心蛋白。 ;2.材料与方法;3.结果;3.1磷酸化和非磷酸化D1蛋白的翻译;在可抑制D1激酶活性的DCMU（敌草隆）存在的条件下，植物在光下迅速的去磷酸化D1-P。在这种条件下，非磷酸化和磷酸化D1比率应该上升。这就是在DCMU处理后的样品用抗-SP2和抗-SP1检测的免疫印迹的情况(Fig. 1C,+DCMU)。用相反的方法，在用DCMU抑制磷酸化，D1-P去磷酸化被NaF（一种磷酸酶抑制剂）抑制的条件下，D1和D1-P水平应该保持不变。这种情况是在单独的实验具有抗SP2(Fig. 1C,+DCMU+NaF). 这些观察证实了抗体的特异性和上部和下部免疫反应条带的识别（Figure1, B and C,），分别是D1-P和非磷酸化D1。这些结果与先前的结论是一致的。 ;3.2 D1-P指数的昼夜振荡;D1-P指数最大值始终在最大光强值之前(Fig. 2A).。 在连续3天和所有其他的条件当试验被重复时，观察24-h振荡(Figs. 3 and 4).。在这些实验中，温室中温度保持不变（Fig.3B）或者被允许上升或下降通过改变光强(Fig. 3A)。如图2a所示的振荡和D1-P指数模式对范围内测得的温度是不重要的(Fig. 3, A B)。这些数据表明当产生光/暗周期的节律的阶段不太受不同温度的影响。在光周期的最后和黑暗中2h，一些植物被移到连续光照条件下（Fig. 2B)或者5分钟的光脉冲（Fig. 2A 箭头在中间的黑条表示）。暗周期被连续光照打断的植物中生物钟被重置，周期被转移，与D1-P指数峰值出现在植物转移到连续光照4h后(Fig. 2B)。然而，暗周期中施加5Min光脉冲不足以诱发生物钟(Fig. 2A, open rectangles).。结果与脉冲的光强无关。植物随后保持在连续光照，24h振荡的自由运行被维持(Fig. 2B, days 2 and 3).。移位的峰值均低于自然光/暗周期中观察到的振幅。这种阻尼在其他生物系统中相似的情况下被观察到。 ;;3.3体内磷酸化的D1反应了D1-P指数振荡;4.讨论;在黑暗中能使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶磷酸化的激酶的昼夜节律调节是有据可查的，并运用在与转录物积累有关的蛋白质丰富度水平。在我们的研究中，体内D1磷酸化的振荡不被体外D1-多肽激酶活性（在整个白天过程中几乎保持不变 数据未显示）反映，D1蛋白合成率——持续上升直到下午很晚的时间，或光抑制。因此，振荡是内源性调节物控制D1的代谢和功能的指示者。 ;D1磷酸化的昼夜节律控制增加了另一个层面对尚未解决的叶绿体功能中光依赖的D1蛋白周转或D1的磷酸化的作用。D1的磷酸化已被表明是关闭PSII的手段，或改变电子传递途径，来保护光合系统避免由强光引起的损伤。然而，磷酸化的最大程度发生在最大光强度数小时前，在光强远低于饱和光合作用或光抑制启动的光强度。 我们注意到，D1降解速率在黑暗中最小但在光强增强的白天上升。可能D1磷酸化的昼